Щелочная фосфатаза

8700,00 руб.

  • Источник: Выделена из кишечника теленка
  • Оптимальный буфер: SE-буфер O
  • Оптимальная температура: 37
Артикул: E328 Категория:

Описание

Источник: Выделена из кишечника теленка

Описание:
Щелочная фосфатаза из кишечника телёнка (англ. CIP) катализируетдефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.

Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 1 мл реакционной смеси за 1 мин при 37°C. Реакционная смесь содержала 1M диэтаноламин-HCl (pH 9.8 при 25°C), 0,5 mM MgCl2,10 mM пара-нитрофенилфосфат.

Оптимальный буфер: SE-буфер O
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 при 25°C); 0.1 mM ZnCl2; 50 mM KCl, 1mM MgCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Примечание:
Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 x SE-буфер O и 0.5 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 37°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli, получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/HindIII.

Протокол дефосфорилирования 5`-концов ДНК с помощью СIP после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
10 x SE буфер для ЭР или буфер “O” — 2 мкл,
ДНК — 0.5-1 мкг,
деионизованная вода — до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при оптимальной температуре.
Добавить 0,2-1 мкл (5-20 ед.) щелочной фосфатазы (E328), перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 37°C.
Очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или путем экстракции фенолом-хлороформом с последующим высаживанием 96%-ным этанолом.
Литература: