Протокол реакции с T4 полинуклеотидкиназой

Т4 полинуклеотидкиназа катализирует перенос (и обмен) концевой фосфатной группы АТФ на 5’-гидроксильный конец двух- и одноцепочечной ДНК (РНК). Также фермент катализирует удаление 3’-фосфорильной группы с 3’-фосфорил-полинуклеотидов, дезоксинуклеозид-3’-монофосфатов и дезоксинуклеозид-3’-дифосфатов. Т4 полинуклеотидкиназа используется, главным образом, для концевого мечения ДНК и РНК и для добавления 5’-фосфата на концы фрагментов ДНК для их последующего лигирования.

Фермент требует присутствия в реакции АТФ в концентрации 1 мМ.

Для радиоактивного мечения рекомендуется использовать 1-50 пмоль ДНК (5’-концы) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей однократный буфер для Т4 полинуклеотидкиназы, 50 пмоль γ-[32P]-АТФ и 10-20 ед. Т4 полинуклеотидкиназы. Инкубировать в течение 30-40 мин при 37°C. При мечении олигонуклеотидов прогреть смесь при 95°C в течение 5 мин.

Для нерадиоактивного фосфорилирования рекомендуется использовать до 300 пмоль ДНК (5’-концы) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей однократный буфер для Т4 полинуклеотидкиназы, 1 мМ АТФ и 10 ед. Т4 полинуклеотидкиназы. Инкубировать в течение 30 мин при 37°C. При необходимости инактивировать фермент прогреванием реакционной смеси при 65°C в течение 20 мин.

Примечание

1. В качестве реакционного буфера можно использовать буфер для Т4 ДНК лигазы.

2. Эффективность фосфорилирования “тупых” концов можно повысить, если перед добавлением фермента прогреть реакционную смесь при 70°C в течение 5 мин и охладить ее во льду. Также можно добавить в реакционную смесь ПЭГ-8,000 до 5% (w/v).

3. Активность Т4 полинуклеотидкиназы ингибируется 150 мМ NaCl (на 50%), 7 мМ фосфатом (на 50%), 7 мМ (NH4)2SO4 (на 75%).