Нами обнаружен бактериальный штамм Peribacillus species 31, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной Pse31I. Фермент узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-GGTCTC-3’и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 1/5: 5’-GGTCTC(N)1^/3’-CCAGAG(N)5^-5’. Таким образом, Pse31I является истинным изошизомером рестриктазы Eco31I. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Pse31I имеет максимальную активность при 37°С и инактивируется инкубацией при 55 и 65°С. Фермент не расщепляет сайты с метилированным цитозином в верхней цепи (5’-GGTCT(5mC)-3’) и/или в нижней цепи (3’-(5mС)CAGAG).

Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ) и температура 37°С.

Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37oС.

Нами выявлен бактериальный штамм Brevundimonas mongoliensis 53, который является продуцентом новой крупнощепящей эндонуклеазы рестрикции, названной BmoI. Фермент BmoI узнает семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’ (W = A или T) и расщепляет ее как указано стрелкой, образуя трехнуклеотидные
5’-выступающие «липкие» концы. BmoI является изошизомером ранее описанной эндонуклеазы рестрикции SanDI. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции BmoI с концентрацией 2000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер W (10 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) и температура реакции 37°С.

Нами выявлен бактериальный штамм Exiguobacterium mexicanum 6, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной EmiI. Фермент EmiS6I узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-CTCTTC-3’ и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 1/4: 5’-CTCTTC(N)1↓-3’/3’-GAGAAG(N)4↓-5’ с образованием 5’-выступающих трехнуклеотидных концов. Таким образом, EmiS6I является изошизомером рестриктаз Ksp632I и Bst6I. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции EmiS6I с концентрацией 5000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер Y (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ) и температура 37°С.

5-метилцитозин-зависимая ДНК-эндонуклеаза GlaI узнаёт в ДНК и расщепляет сайты 5′-R(5mC)GY-3′ / 3′-YG(5mC)R-5′, которые образуются de novo в геноме человека под действием ДНК-метилтрансферазы DNMT3. Благодаря своей специфичности фермент GlaI эффективно используется для определения статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека. Геномное картирование сайтов R(5mC)GY осуществляется методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) гидролизатов ДНК, полученных расщеплением GlaI, тогда как анализ отдельных фрагментов ДНК может быть выполнен с помощью GlaI-ПЦР анализа.

В данной работе проведено сравнение результатов NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и данных GlaI-ПЦР анализа регуляторных областей 11 генов-онкосупрессоров в ДНК клеточных линий человека L68 (нормальные фибробласты лёгких), Raji (лимфома Беркитта) и U937 (гистиоцитарная лимфома). Показано, что в ДНК клеток L68 большинство исследованных регуляторных участков неметилированы, тогда как в ДНК злокачественных клеточных линий Raji и U937 наблюдается их метилирование. За исключением одного участка для всех остальных исследованных фрагментов статус метилирования, определённый методом GlaI-ПЦР анализа, полностью коррелирует с количеством сайтов R(5mC)GY, выявленных методом NGS.

Единственное расхождение между данными двух методов было выявлено в случае регуляторного участка гена RASSF1A в ДНК клеток L68, которое объясняется наличием аллель-специфического метилирования, подтверждённого дополнительным GlaI-ПЦР анализом в режиме реального времени. С учётом наличия аллельного метилирования регуляторного участка гена RASSF1A можно говорить о полном соответствии между данными NGS GlaI-гидролизатов и GlaI-ПЦР анализа ДНК регуляторных областей изученных генов-онкосупрессоров клеточных линий человека L68, Raji и U937.

Таким образом, методы NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и GlaI-ПЦР анализа являются взаимодополняющими и позволяют надёжно выявлять аномально метилированные участки генома в нормальных и опухолевых клетках, что делает их перспективными инструментами для эпигенетических исследований и ДНК-диагностики.

Нами обнаружен бактериальный штамм Paracoccus species 12, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PecI. Этот фермент узнает шестинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-TTA^TAA-3’ и расщепляет ее с образованием «тупых» концов, как показано стрелкой. Таким образом, PecI является истинным изошизомером рестриктазы PsiI.

Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37°C.