Список всех публикаций
-
Эндонуклеаза рестрикции Pse31I из штамма бактерии Peribacillus species 31, изошизомер Eco31I, узнает непалиндромную последовательность ДНК 5’-GGTCTC-3’ (1/5) // ДНК-узнающие ферменты, том 2025(1), DOI: 10.26213/3034-4301.2025.4.1.001 (2025).
Аннотация
Нами обнаружен бактериальный штамм Peribacillus species 31, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной Pse31I. Фермент узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-GGTCTC-3’и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 1/5: 5’-GGTCTC(N)1^/3’-CCAGAG(N)5^-5’. Таким образом, Pse31I является истинным изошизомером рестриктазы Eco31I. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Pse31I имеет максимальную активность при 37°С и инактивируется инкубацией при 55 и 65°С. Фермент не расщепляет сайты с метилированным цитозином в верхней цепи (5’-GGTCT(5mC)-3’) и/или в нижней цепи (3’-(5mС)CAGAG).
Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ) и температура 37°С.
Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37oС. -
Эндонуклеаза рестрикции BmoI из штамма бактерии Brevundimonas mongoliensis 53 узнает последовательность ДНК 5’-GG^GWCCC-3’. // ДНК-узнающие ферменты, том 2025(2), DOI: 10.26213/3034-4301.2025.5.2.002 (2025).
Аннотация
Нами выявлен бактериальный штамм Brevundimonas mongoliensis 53, который является продуцентом новой крупнощепящей эндонуклеазы рестрикции, названной BmoI. Фермент BmoI узнает семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’ (W = A или T) и расщепляет ее как указано стрелкой, образуя трехнуклеотидные
5’-выступающие «липкие» концы. BmoI является изошизомером ранее описанной эндонуклеазы рестрикции SanDI. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции BmoI с концентрацией 2000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер W (10 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) и температура реакции 37°С. -
Эндонуклеаза рестрикции EmiI, изошизомер Ksp632I, узнает непалиндромную последовательность ДНК 5’-CTCTTC(1/4)-3’. // ДНК-узнающие ферменты, том 2025(4), DOI: 10.26213/3034-4301.2025.7.4.002 (2025).
Аннотация
Нами выявлен бактериальный штамм Exiguobacterium mexicanum 6, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной EmiI. Фермент EmiI узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-CTCTTC-3’ и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 1/4: 5’-CTCTTC(N)1↓-3’/3’-GAGAAG(N)4↓-5’ с образованием 5’-выступающих трехнуклеотидных концов. Таким образом, EmiI является изошизомером рестриктаз Ksp632I и Bst6I. Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции EmiI с концентрацией 5000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер Y (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ) и температура 37°С.
-
Определение статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека: сравнение результатов NGS GlaI-гидролизатов и данных GlaI-ПЦР анализа, // Эпигенетическая ДНК диагностика, том 2025(1), DOI: 10.26213/3034-4298.2025.6.1.001 (2025).
Аннотация
5-метилцитозин-зависимая ДНК-эндонуклеаза GlaI узнаёт в ДНК и расщепляет сайты 5′-R(5mC)GY-3′ / 3′-YG(5mC)R-5′, которые образуются de novo в геноме человека под действием ДНК-метилтрансферазы DNMT3. Благодаря своей специфичности фермент GlaI эффективно используется для определения статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека. Геномное картирование сайтов R(5mC)GY осуществляется методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) гидролизатов ДНК, полученных расщеплением GlaI, тогда как анализ отдельных фрагментов ДНК может быть выполнен с помощью GlaI-ПЦР анализа.
В данной работе проведено сравнение результатов NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и данных GlaI-ПЦР анализа регуляторных областей 11 генов-онкосупрессоров в ДНК клеточных линий человека L68 (нормальные фибробласты лёгких), Raji (лимфома Беркитта) и U937 (гистиоцитарная лимфома). Показано, что в ДНК клеток L68 большинство исследованных регуляторных участков неметилированы, тогда как в ДНК злокачественных клеточных линий Raji и U937 наблюдается их метилирование. За исключением одного участка для всех остальных исследованных фрагментов статус метилирования, определённый методом GlaI-ПЦР анализа, полностью коррелирует с количеством сайтов R(5mC)GY, выявленных методом NGS.
Единственное расхождение между данными двух методов было выявлено в случае регуляторного участка гена RASSF1A в ДНК клеток L68, которое объясняется наличием аллель-специфического метилирования, подтверждённого дополнительным GlaI-ПЦР анализом в режиме реального времени. С учётом наличия аллельного метилирования регуляторного участка гена RASSF1A можно говорить о полном соответствии между данными NGS GlaI-гидролизатов и GlaI-ПЦР анализа ДНК регуляторных областей изученных генов-онкосупрессоров клеточных линий человека L68, Raji и U937.
Таким образом, методы NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и GlaI-ПЦР анализа являются взаимодополняющими и позволяют надёжно выявлять аномально метилированные участки генома в нормальных и опухолевых клетках, что делает их перспективными инструментами для эпигенетических исследований и ДНК-диагностики. -
Аннотация
Нами обнаружен бактериальный штамм Paracoccus species 12, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PecI. Этот фермент узнает шестинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-TTA^TAA-3’ и расщепляет ее с образованием «тупых» концов, как показано стрелкой. Таким образом, PecI является истинным изошизомером рестриктазы PsiI.
Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37°C. -
Аннотация
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) заключается в замене одного нуклеотида на другой, что часто приводит к возникновению (или исчезновению) сайта узнавания определенной рестриктазы. В результате при амплификации фрагмента ДНК с праймеров, окружающих точку SNP (содержащую либо N1, либо N2-нуклеотид), и последующего гидролиза ампликона данной рестриктазой картины расщепления ДНК будут разные для трех возможных вариантов в диплоидной ДНК (генотипы N1/N1, N1/N2 и N2/N2). Данный метод определения полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) широко используется в практике генетических исследований. Ранее мы разработали методы GlaI- и FatI-ПЦР анализа, в которых проводится ПЦР в реальном времени вместо электрофореза, и показали его применимость для определения SNP T/C. В настоящей работе предложен новый способ определения однонуклеотидного полиморфизма G/C методом Bst2UI-ПЦР анализа. GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализ использовали для определения частоты вариантов полиморфизма G/C в положении хр20:37352001 (по геномной сборке GRCh38.p14) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 161 человека. Исследование включало: 1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови; 2) проведение GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр20:37351957–37352083; 3) определение цитозина и гуанина в позиции хр20:37352001 в анализируемых препаратах ДНК; 4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 68 доноров (42.2%) имеют гетерозиготный набор G/C в положении хр20:37352001, 89 доноров (55.3%) гомозиготны по G, а четыре донора (2.5%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена G на C встречается в 76 из 322 проанализированных вариантов (23.6%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин, комплементарный G в положении хр20:37352001, в большей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин) как у гомо-, так и у гетерозигот. Предложенный метод Bst2UI-ПЦР анализа расширяет возможности определения SNP с помощью ПЦР в реальном времени.
-
Определение полиморфизма 5mC/T в позиции Chr1: 245618129 в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2019.69.42836 (2021).
Аннотация
Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в положении хр1: 245618129 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр1: 245617889 — 245618464, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции хр1: 245618129 в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов.
Показано, что 43 донора (46,74%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр1: 245618129, 28 доноров (30,43%) гомозиготны по T, а 21 донор (22,83%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 99 из 184 проанализированных вариантов (53,8%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр1: 245618129 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин). -
Оценка риска возникновения рака молочной железы и рака желудка путем определения вариантов полиморфизма 5mC/T в интроне гена KIF26B в положении хр1: 245618129 // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2019.78.40307 (2021).
Аннотация
Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в положении хр1: 245618129 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 51 больного раком молочной железы (РМЖ) и 63 больных раком желудка (РЖ). Полученные данные были сравнены с аналогичными показателями для 92 здоровых доноров крови, установленными ранее.
Показано, что цитозиновое основание в данной позиции находится преимущественно в метилированной форме во всех образцах ДНК. Встречаемость диплоидного набора C/C в указанной позиции у больных РМЖ и РЖ составляет 9.8% и 7.94%, соответственно. Это существенно отличается от встречаемости гомозигот по C у здоровых женщин (26.09%) и здоровых доноров обоих полов (22.83%). Таким образом, наличие у людей генотипа С/С в положении хр1: 245618129 является благоприятным признаком, свидетельствующим о пониженном в 2.7-2.9 раз риске возникновения РМЖ и РЖ по сравнению со среднепопуляционными значениями. При этом встречаемость гетерозигот C/T и гомозигот T/T у больных РЖ и РМЖ превышает аналогичные показатели для контрольных групп здоровых людей на 5.5-10.7%. -
Определение полиморфизма 5mC/T в повторе AluSx (CHR16: 75033884) в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2021.11.76.001 (2021).
Аннотация
Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в повторе AluSx в положении хр16: 75033884 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр16: 75033860 — 75033957, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции (хр16: 75033884) в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов.
Показано, что 53 донора (57,61%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр16: 75033884, 19 доноров (20,65%) гомозиготны по T, а 20 доноров (21,74%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 91 из 184 проанализированных вариантов (49,46%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр16: 75033884 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин), что согласуется с положением о преимущественном метилировании CG-динуклеотидов в Alu-повторах. -
Изучение метилирования сайтов RCGY в регуляторной области гена FAM19A4 в препаратах ДНК клеточных линий человека методом GLAD-ПЦР анализа // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2021.97.62.001 (2021).
Аннотация
Методом GLAD-ПЦР анализа определяли метилирования сайтов RCGY в регуляторной области гена FAM19A4 (Хр3: 68932451 — 68932800) в препаратах ДНК малигнантных клеточных линий человека Raji, Jurkat, HeLa, U-937 и контрольной ДНК клеточной линии фибробластов легких L68.
Показано, что октануклеотид GCGCGCGC (Хр3: 68932500), находящийся в первом экзоне гена FAM19A4, расщепляется приблизительно в равной степени в ДНК всех 4-х малигнантных клеточных линий человека, тогда как в ДНК L68 этом сайт гидролизуется в 10-15 раз слабее. Эти результаты соответствуют полученным ранее данным эпигеномного секвенирования ДНК L68, Raji и U-937.
Метилирование CG-динуклеотидов в позициях 68932727 и/или 68932740 в районе промотора гена FAM19A4 происходит только в опухолевых ДНК и не наблюдается в ДНК L68, а метилирование CG-динуклеотида в позиции 68932704 наблюдается только в ДНК HeLa. -
Аннотация
ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда (ПЦР РВ) является одним из основных методов анализа структуры ДНК человека и широко используется в медицине. В данной работе проводили ПЦР РВ 4-х фрагментов геномной ДНК человека (chr1: 90717178-90717300, chr9: 97464604-97464756, chr11: 65647215-65647307, chr17: 4560027-4560175), используя в качестве матрицы препараты ДНК из крови человека, полученные как стандартным методом фенольной депротеинизации, так и выделенные на колонках. В ПЦР использовались как препараты исходной ДНК, так и после ее обработки рестриктазой, выщепляющей амплифицируемый фрагмент. В случае препаратов нативной ДНК, очищенных на колонках, ПЦР на 3-х из 4-х фрагментов ДНК дает завышенное значение Cq. В случае фенольной очистки завышенное значение Cq для препаратов нативной ДНК получается для 2-х из 4-х фрагментов ДНК. В случае препаратов ДНК, полученных после очистки на колонке, обработка ДНК эндонуклеазой рестрикции, вырезающей амплифицируемый фрагмент, приводит к получению нормальных значений Cq для всех четырех анализируемых фрагментов ДНК. Таким образом, ПЦР РВ с нативной ДНК, полученной очисткой на колонках, может давать завышение Cq, которое снимается, если предварительно провести гидролиз ДНК рестриктазой, выщепляющей ампликон.
-
GlaD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудка // Acta Naturae, 2020, том 12, № 3(46): 124-133 (2020).
Аннотация
На ранних стадиях канцерогенеза опухолевая ДНК подвергается аберрантному метилированию регуляторных областей ряда генов-супрессоров опухолевого роста по сайтам RCGY, являющимся субстратами для ДНК-метилтрансферазы Dnmt3. Выявление аберрантно метилированных сайтов в ДНК различных опухолей считается первым шагом в создании эпигенетических ПЦР-тест-систем для ранней диагностики онкологических заболеваний. Ранее нами был разработан метод GLAD-ПЦР, позволяющий определять сайт R(5mC)GY в заданной позиции генома человека даже при значительном избытке молекул ДНК, содержащих в этой позиции неметилированный сайт RCGY.
Целью настоящей работы было выявление аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-супрессоров опухолевого роста (brinp1, bves, cacna2d3, cdh11, cpeb1, epha7, fgf2, galr1, gata4, hopx, hs3st2, irx1, lrrc3b, pcdh10, rprm, runx3, sfrp2, sox17, tcf21, tfpi2, wnt5a, zfp82 и znf331) в препаратах ДНК тканей рака желудка с помощью GLAD-ПЦР-анализа.
На образцах ДНК, выделенных из операционного материала опухолей (n = 29) и морфологически неизмененных тканей (n = 25), показан высокий диагностический потенциал панели эпигенетических маркеров рака желудка, включающей сайты R(5mC)GY в регуляторных областях генов irx1, cacna2d3 и epha7. Суммарные показатели чувствительности и специфичности панели составили 96,6% и 100,0% соответственно. -
Сравнение субстратной специфичности рекомбинантной сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и нативного фермента, выделенного из штамма Glacial ice bacterium // ДНК-узнающие ферменты , DOI: 10.26213/SE.2019.81.28075 (2019).
Аннотация
В настоящей работе описано клонирование сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и проведено сравнение субстратной специфичности рекомбинантного и нативного ферментов. Проведённый анализ свойств рекомбинантной эндонуклеазы GlaI показал, что субстратная специфичность нативного и рекомбинантного фермента не отличаются, но, ввиду большего количества фермента в рекомбинантном штамме, его концентрация в конечном препарате более чем в 10 раз превышает концентрацию нативного фермента.
-
GlaI-ПЦР анализ метилирования сайта ACGC в хp11: 65647266 в препаратах ДНК клеток крови в норме и на ранних стадиях рака молочной железы // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2019.66.12.001 (2019).
Аннотация
Методом GlaI-ПЦР анализа изучали метилирование сайта ACGC в гене SIPA1 в положении хр11: 65647266 (согласно базе данных GRCh38 PrimaryAssembly) в препаратах ДНК, полученных из легкой фракции клеток крови доноров и больных раком молочной железы на ранних стадиях заболевания. Исследование включало а) получение легкой фракции клеток крови, б) выделение геномной ДНК, в) установление методом ПЦР в реальном времени концентрации геномной ДНК, г) определение методом GlaI-ПЦР-анализа концентрации неметилировнного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в препаратах ДНК из легкой фракции клеток крови и д) определение доли молекул ДНК, содержащих неметилированный сайт ACGC, выраженной в процентах от общего количества молекул ДНК.
GlaI-ПЦР анализ показал, что у более чем 82% доноров доля неметилированного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в ДНК из легкой фракции клеток крови составляет 3% и менее, тогда как у приблизительно 70% больных РМЖ процент неметилированного сайта ACGC выше и находится в диапазоне от 3,2 до 6,4%. Эти данные позволяют предположить, что при РМЖ на ранних стадиях у 2/3 больных в ДНК небольшой части лейкоцитов (до 3,5%) происходит деметилирование сайта A(5mC)GC в гене SIPA1 в положении 65647266.
Данные, представленные в данной работе, могут быть использованы для разработки ПЦР тест-системы, позволяющей исключить РМЖ на ранних стадиях. Метод GlaI-ПЦР анализа не требует сложного и дорогостоящего оборудования и реактивов, а само исследование может проводиться в стандартной ПЦР-лаборатории в ходе ежегодных профилактических обследований и анализа крови. -
НОВАЯ ЭНДОНУКЛЕАЗА РЕСТРИКЦИИ LmnI УЗНАЕТ И РАСЩЕПЛЯЕТ НЕПАЛИНДРОМНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК 5`-GCTCC(1/-1)-3` // ДНК-узнающие ферменты, DOI: 10.26213/SE.2019.99.27373, (2019).
Аннотация
Выделенный нами из природных изолятов бактериальный штамм Lysinibacillus manganicus An22 является продуцентом эндонуклеазы рестрикции LmnI, узнающей непалиндромную последовательность ДНК 5’-GCTCC-3’/3’-CGAGG-5’. Данная последовательность представляет собой новый прототип сайтов узнавания рестриктаз. Препарат эндонуклеазы рестрикции LmnI с концентрацией 1000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Показано, что новый фермент гидролизует ДНК с образованием 3’-выступающих “липких” двухнуклеотидных концов как показано стрелками — 5’-GCTCCN↓-3’/3’-CGAG↑GN-5’, и относится к подтипу IIS эндонуклеаз рестрикции.
-
Application of GLAD-PCR Assay for Study on DNA Methylation in Regulatory Regions of Some Tumor-Suppressor Genes in Lung Cancer // Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2019 Sep 20;22(9):551-561.
Аннотация
Гиперметилирование регуляторных участков генов является характерной чертой многих онкологических заболеваний. В данной работе мы применили метод GLAD-ПЦР для выявления участков RCGY с аномальным метилированием в регуляторных участках ряда генов с пониженной экспрессией в тканевых образцах рака легких (РЛ). В этот список входят гены EFEMP1, EPHA5, HOXA5, HOXA9, LHX1, MYF6, NID2, OTX1, PAX9, RARB, RASSF1A, RXRG, SIX6, SKOR1 и TERT. Результаты анализа образцов ДНК из 40 образцов раковых и 25 образцов нормальных тканей легких продемонстрировали хороший диагностический потенциал выбранных сайтов RCGY в регуляторных областях генов MYF6, SIX6, RXRG, LHX1, RASSF1A и TERT с относительно высокой чувствительностью (80,0 %) и специфичностью (88,0 %) выявления РЛ в опухолевой ДНК.
-
Сравнительный анализ метилирования сайтов RCGY в геномах клеточных линий L-68, Raji и U-937 // Эпигененическая ДНК диагностика, том 2019(1), DOI: 10.26213/SE.2019.76.40116 (2019).
Аннотация
В настоящей работе представлены результаты картирования метилированных сайтов RCGY в геномах двух малигнантных клеточных линий и контрольной клеточной линии фибробластов легких. Проведенный анализ выявил существенные отличия по метилированию генов, повторов, CpG-островков между тремя геномами. Обнаружены различия по степени метилирования различных групп повторов, которые, возможно, могут быть использованы в диагностических целях при условии разработки достаточно чувствительных методов анализа. Создана база данных, содержащая результаты картирования метилированных сайтов в геномах. Полученные данные по метилированию регуляторных участков различных генов, сопоставленные с ранее опубликованными данными, могут быть использованы для поиска маркеров метилирования для диагностики онкологических и некоторых других заболеваний. Таким образом, разработанный простой и нетрудоемкий метод картирования метилированных сайтов R(5mC)GY в геномах может быть использован на практике.
-
Comparative analysis of RCGY sites methylation in the genomes of Raji and U-937 malignant and normal lung fibroblast cell lines // Материалы конференции Cancer Epigenetics and Biomarkers, Osaka, Japan, October 2017. (На английском)
Аннотация
Нарушение метилирования регуляторных участков генома может привести к сбоям в нормальном функционировании клеток и часто сопровождает заболевания человека, в том числе рак. Таким образом, маркеры метилирования ДНК обладают значительной диагностической ценностью и привлекают внимание многих исследователей в области биомедицины. К сожалению, существующие подходы к геномному изучению метилирования являются довольно дорогостоящими и трудоемкими. Мы разработали и успешно протестировали новый метод картирования метилированных участков в геномах. Метод основан на свойстве метилзависимой сайт-специфичной эндонуклеазы ДНК GlaI расщеплять ДНК исключительно в сайтах R(5mC)GY с образованием фрагментов с тупыми концами [1]. Последующее секвенирование нового поколения фрагментов, полученных после гидролиза ДНК злокачественной клеточной линии Raji ферментом GlaI, позволяет выявить более 2 617 000 позиций сайтов R(5mC)GY в геноме [2]. Мы применили этот подход для выявления дифференциально метилированных сайтов RGCY в геномах злокачественных клеточных линий Raji и U-937, а также незлокачественной линии легочных фибробластов L-68. Положения метилированных сайтов RGCY в геномах были определены с помощью парного секвенирования длиной 75 п.н. фрагментов GlaI длиной 140–400 п.н. на приборе Illumina Genome Analyzer IIx. Сравнение полученных данных выявило значительные различия в метилировании сайтов RGCY в CpG-островках, предполагаемых регуляторных областях и некоторых семействах повторяющихся участков ДНК между всеми тремя геномами злокачественных и доброкачественных клеток. Анализ обогащения по GO генов с высокометилированными регуляторными областями выявил метаболические процессы, на которые может оказываться эпигенетическое влияние в процессе канцерогенеза. Новый метод позволяет определять положения множества модифицированных цитозиновых оснований в геномах и может стать простой альтернативой существующим методам геномного анализа метилирования.
-
GLAD-PCR assay of selected R(5mC)GY sites in URB1 and CEPBD genes in human genome // Res J Pharm Biol Chem Sci, 8(1): pp.465-475, 2017. (На английском)
Аннотация
Оптимальные условия проведения анализа GLAD-PCR сайта A(5mC)GT в гене URB1 в ДНК человека были определены следующим образом: гибридный праймер с 4 дополнительными основаниями, 0,33 единицы ДНК-полимеразы SP-Taq в 20 мкл реакционной смеси, концентрация MgCl₂ — 3 мМ, концентрация ДНК-лигазы — 10 Е/мкл. Анализ методом GLAD-PCR тандема сайтов GCGC в гене CEBPD был проведен в этих оптимальных условиях и подтвердил полное метилирование тандема сайтов GCGC в ДНК из линий раковых клеток Raji, U-937 и Jurkat. Мы полагаем, что эти условия могут также использоваться для анализа методом GLAD-PCR других сайтов R(5mC)GY в геномах млекопитающих. Четкие и отчетливые кривые накопления флуоресценции в случае метилированных сайтов и отсутствие флуоресцентного сигнала в случае неметилированных сайтов свидетельствуют о большом потенциале метода GLAD-PCR в анализе метилирования ДНК.
-
Применение сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз в полногеномном анализе ДНК человека // Генетика, Том 53, № 1, Стр. 3-11 (2017).
Аннотация
На протяжении последних десятилетий сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы служат одним из ключевых инструментов для изучения первичной структуры ДНК и генно-инженерных манипуляций. В обзоре рассмотрены примеры использования этих ферментов при полногеномном анализе ДНК человека, включающие применение эндонуклеаз рестрикции в пробоподготовке при секвени-ровании на NGS-машинах, а также визуализацию расщепления ДНК-повторов рестриктазами. Особый интерес представляют первые работы по применению ДНК-эндонуклеаз в быстро развивающейся области эпигенетического анализа геномов, чему способствует недавнее открытие нового класса ферментов — 5-метилцитозин-зависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз.
-
Complete Genome Sequence and Methylome Analysis of Acinetobacter calcoaceticus 65. // Genome Announc. 2017 Mar 23;5(12). pii: e00060-17. doi: 10.1128/genomeA.00060-17.(2017). (На английском)
Аннотация
Acinetobacter calcoaceticus 65 является исходным штаммом для рестрикционного фермента Acc65I. Его полная последовательность и полный метиломик были определены с помощью одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT).
-
Dimethyl Sulfoxide Changes the Recognition Site Preference of Methyl-directed Site-specific DNA Endonuclease GlaI. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, № 7(1),с. 1733-1739 (2016). (На английском)
Аннотация
Метил-специфическая сайт-специфическая эндонуклеаза ДНК GlaI распознает и расщепляет метилированную последовательность ДНК RCGY. Активность GlaI при гидролизе распознавательной последовательности, содержащей два 5-метилцитозина, заметно ниже, чем в случае сайта с четырьмя или тремя 5-метилцитозинами. Мы показали, что добавление ДМСО в реакционную смесь значительно повышает активность GlaI при гидролизе сайтов с двумя 5-метилцитозинами, но не изменяет субстратную специфичность фермента. Реакционный буфер с ДМСО может использоваться в эпигенетических исследованиях для расщепления GlaI эукариотических геномов, содержащих метилированные пары CG.
-
Real time GlaI-PCR assay of regulation regions of human genes HDAC4, RARB and URB1 // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, vol 7(2), p.p. 667-676 (2016). (На английском)
Аннотация
Разработан метод GlaI-ПЦР в режиме реального времени для определения статуса метилирования ДНК в регуляторных областях генов HDAC4, URB1 и RARB в препаратах ДНК из лейкоцитов человека. Метод GlaI-ПЦР в режиме реального времени представляет собой гидролиз ДНК с помощью метил-направленной сайт-специфической эндонуклеазы GlaI с последующей ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров, расположенных выше и ниже исследуемого участка ДНК. Полученные данные подтверждают полное метилирование исследуемых сайтов ACGT и GCGC в регуляторных областях генов HDAC4 и URB1, а также полный гидролиз этих сайтов ферментом GlaI. Первый экзон гена RARB в ДНК-препаратах лейкоцитов метилирован в незначительной степени, и, согласно результатам анализа GlaI-ПЦР, гидролиза сайта ACGCG в гене RARB ферментом GlaI не наблюдается. Полученные данные соответствуют данным литературы. Предложенный метод анализа GlaI-ПЦР в реальном времени может быть использован для определения статуса метилирования любых уникальных участков в геномах человека и млекопитающих.
-
Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке // Вопросы онкологии, №1, стр. 116-120. (2016)
Аннотация
Аберрантное метилирование регуляторных областей генов-онкосупрессоров показано для многих онкологических заболеваний. В данной работе разработанный нами ранее метод GLAD-ПЦР анализа [3] был применен для выявления сайтов R(5mC)GY, возникающих при аберрантном метилировании регуляторных областей генов ELMO1 и ESR1 в препаратах ДНК клеточной линии SW837 и тканей опухоли толстой кишки. Были отобраны по 4 сайта для каждого гена и установлено, что в ДНК SW837 наиболее метилированными являются сайт GCGC в первом экзонe гена ELMO1 и сайт GCGT в промоторе гена ESR1. Сайт GCGT в промоторе гена ESR1 слабо метилирован в здоровых тканях и более метилирован в большинстве опухолевых тканей. Сайт GCGC в первом экзонe гена ELMO1 неметилирован в ДНК здоровых тканей и метилирован в 60% образцов опухолевых ДНК. Обсуждаются возможности применения метода GLAD-ПЦР анализа препаратов внеклеточной ДНК крови пациентов для диагностики колоректального рака.
-
Comparative analysis of biochemical properties of site specific methyl-directed DNA endonucleases BisI, BlsI and EcoBLI recognizing 5`-G(5mC)NGC-3`/3`-CGN(5mC)G-5` // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, RJPBCS, vol 7(2), p.p. 388-394 (2016). (На английском)
Аннотация
Был проведен сравнительный анализ биохимических свойств трех сходных сайтоспецифических метил-направленных эндонуклеаз ДНК — BisI, BlsI и EcoBLI, распознающих последовательность 5'-G(5mC)NGC-3'/3'-CGN(5mC)G-5'. Были определены оптимальные концентрации MgCl₂, NaCl или KCl, pH реакционных буферов, а также оптимальные температуры реакции для этих ферментов. Было показано, что BisI проявляет максимальную активность в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 9,0 при 25 °C), 15 мМ MgCl₂, 150 мМ KCl и 1 мМ DTT. Оптимальным буфером для MD-эндонуклеазы BlsI является буфер, содержащий 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0 при 25 °C), 15 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ DTT. Фермент EcoBLI проявляет максимальную активность в буфере 10 мМ Tris-HCl (pH 8,5 при 25 °C), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT. Оптимальная температура для всех ферментов составляет 37 °C.
-
GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer // Biol Med (Aligarh) , 8:7(2016). (На английском)
Аннотация
Гиперметилирование регуляторных участков генов зафиксировано при многих онкологических заболеваниях. Такое аномальное метилирование ДНК в раковых клетках катализируется ДНК-метилтрансферазами Dnmt3a и Dnmt3b, которые преимущественно распознают и метилируют последовательности RCGY с образованием сайтов R(5mC)GY. Недавно на основе новой метил-направленной ДНК-эндонуклеазы GlaI мы разработали метод GLAD-ПЦР, позволяющий определять сайты R(5mC)GY в определённой позиции геномной ДНК. В данной работе мы применили анализ GLAD-PCR для идентификации метилированных сайтов RCGY в регуляторных областях ряда генов с пониженной экспрессией, связанных с колоректальным раком (КРР). В этот список входят гены ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM. Анализ методом GLAD-ПЦР выбранных сайтов RCGY в регуляторных областях некоторых из этих генов демонстрирует хороший прогностический потенциал с относительно высокой чувствительностью и специфичностью выявления КРР в опухолевой ДНК.
-
New DNA methyltransferase M.AgsI produces TTSA(m6A) // BioTechnology : An Indian Journal. V. 12 (2). – P. 100-106 (2016). (На английском)
Аннотация
[ПЕРЕВОД] Фрагмент ДНК Agrococcus sp. 25 был клонирован в плазмиду pUC19 штамма Escherichia coli. Клонированный фрагмент содержал две открытые рамки считывания, кодирующие белки с восемью консервативными аминокислотными мотивами, характерными для N6-адениновых ДНК-метилтрансфераз. На основании анализа аминокислотной последовательности было предположено, что M.AgsI является первой субъединицей N6-адениновой ДНК-метилтрансферазы.
Фермент был очищен из рекомбинантного штамма с использованием последовательной хроматографии на фосфоцеллюлозе P-11, гепарин-сефарозе и гидроксиапатите. Специфичность M.AgsI определяли по защите ДНК бактериофага λ, метилированной этим ферментом, от расщепления различными эндонуклеазами рестрикции. Также была исследована чувствительность ряда эндонуклеаз рестрикции к метилированию, осуществляемому M.AgsI. -
Клонирование и характеристика новой сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы EcoBLI, узнающей последовательность 5′-G(5mC)NGC-3′/3′-CGN(5mC)G-5′ // BioTechnology: An Indian Journal. Volume 12, Issue 4, Pages 175-181 (2016). (На английском)
Аннотация
[ПЕРЕВОД] Ген BisI — сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы, узнающей последовательность 5′-G(5mC)NGC-3′/3′-CGN(5mC)G-5′, — недавно был идентифицирован в секвенированном геноме штамма-продуцента Bacillus subtilis T30. В настоящей работе был проведен поиск гомологов гена bisI среди секвенированных геномов энтеробактерий. Анализ последовательностей ДНК выявил небольшую группу высокогомологичных открытых рамок считывания (ORF) с неизвестной функцией, включая одну ORF в геноме хорошо изученного штамма Escherichia coli.
ORF WP_001276099.1 из E. coli BL21(DE3) была амплифицирована и клонирована. Полученный рекомбинантный штамм E. coli pEcoBLI продуцировал метилзависимую эндонуклеазу, названную EcoBLI. Новый фермент обладает такой же субстратной специфичностью, как и метилзависимая эндонуклеаза BisI. Таким образом, ORF WP_001276099.1 из E. coli BL21(DE3) кодирует сайт-специфическую метилзависимую ДНК-эндонуклеазу EcoBLI, которая узнает и расщепляет последовательность 5′-G(5mC)^NGC-3′/3′-CGN^(5mC)G-5′. -
Expression and purification of the modification-dependent restriction enzyme BisI and its homologous enzymes. // Sci Rep. 2016 Jun 29;6:28579. doi: 10.1038/srep28579.(2016). (На английском)
Аннотация
В Bacillus subtilis T30 обнаружена метилируемая рестрикционная эндонуклеаза (REase) BisI (G(m5)C ↓ NGC). Мы провели экспрессию и очистку эндонуклеазы BisI, а также 34 гомологов BisI, идентифицированных в геномах бактерий. 23 из этих гомологов BisI обладают активностью, что подтверждается расщеплением субстратов, модифицированных (m5)C. Среди ферментов семейства BisI было выявлено две основные специфичности: ферменты группы I расщепляют последовательности GCNGC, содержащие от двух до четырёх (m5)C в обеих цепях, либо гемиметилированные сайты, содержащие два (m5)C в одной цепи; ферменты группы II расщепляют только сайты GCNGC, содержащие от трёх до четырёх (m5)C, причём один из ферментов требует модификации всех четырёх цитозинов для расщепления. Еще один гомолог, Esp638I, расщепляет GCS ↓ SGC (ослабленная специфичность RCN ↓ NGY, содержащий не менее четырех (m5)C). Два гомолога BisI демонстрируют вырожденную специфичность, расщепляя немодифицированную ДНК. Многие гомологи представляют собой небольшие белки, содержащие от 150 до 190 аминокислотных (аа) остатков, однако некоторые гомологи, связанные с мобильными генетическими элементами, имеют больший размер и содержат дополнительный С-концевой домен. Более 156 гомологов BisI обнаружены в более чем 60 родах бактерий, что свидетельствует о широком распространении этих ферментов среди бактерий. Они, возможно, выполняют важную биологическую функцию, ограничивая действие предварительно модифицированной фаговой ДНК.
-
Клонирование и характеристика новой сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазы ElmI, узнающей и расщепляющей С5-метилированную последовательность ДНК 5`-G(5mC)^NG(5mC)-3` // Acta Naturae, Том 8, № 1, Стр. 127-136 (2016).
Аннотация
В результате поиска аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательности MD-эндонуклеазы BisI, в геномах энтеробактерий выявлены предполагаемые открытые рамки считывания MD-эндонуклеаз. Высокая консервативность нуклеотидных последовательностей данных рамок у энтеробактерий разных родов (Escherichia, Klebsiella и Cronobacter) позволила создать праймеры для проведения ПЦР-скрининга на ДНК энтеробактерий, собранных из природных источников. С использованием геномной ДНК E. coli LM N17 в качестве матрицы амплифицирован и встроен в вектор pMTL22 фрагмент ДНК длиной около 440 п.н. В штамме E. coli ER2267, трансформированном полученной конструкцией, выявлена эндонуклеазная активность. Из биомассы данного штамма хроматографическими методами получен препарат нового фермента ElmI. Оказалось, что ElmI подобно BisI специфично расщепляет метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’ перед центральным нуклеотидом «N» при условии, что она содержит два остатка 5-метилцитозина. Однако, в отличие от BisI, ElmI с большей эффективностью расщепляет эту последовательность при наличии в ней более двух метилированных остатков цитозина.
-
Complete Genome Sequence Analysis of Bacillus subtilis T30. // Genome Announc. 2015 May 7;3(3). pii: e00395-15. doi: 10.1128/genomeA.00395-15. PMID:25953183. (На английском)
Аннотация
[ПЕРЕВОД] Полная последовательность генома Bacillus subtilis T30 была определена методом SMRT-секвенирования. Геном содержит 4138 предсказанных генов. В геноме выявлены одна интактная последовательность профага длиной 37,4 тыс. п.н., сходная с бактериофагом Bacillus SPBc2, а также один неполный геном профага длиной 39,9 тыс. п.н., сходный с бактериофагом Bacillus phi105.
-
Cloning and Study of NewDNA Methyltransferase M.FatI Modifying Cytosine in a Recognition Site CATG. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, vol 6 (6), P. 1341-1348.(2015). (На английском)
Аннотация
Фрагмент ДНК Flavobacterium aquatile NL3, несущий ген ДНК-метилтрансферазы M.FatI,
был клонирован в плазмиду pUC19. Было проведено секвенирование ДНК и анализ гена M.FatI. Рекомбинантный штамм
Escherichia coli был выращен, и фермент был очищен. Специфичность M.FatI была определена методом блокирования
некоторых рестриктаз и с помощью компьютерного моделирования. Хорошо известно, что M.NlaIII продуцирует 5’-C(m6A)TG3’, тогда как метилтрансфераза FatI модифицирует остаток цитозина с образованием 5’-(m5C)ATG-3’. Была изучена чувствительность
рестрикционных эндонуклеаз к метилированию FatI.
Ключевые слова: клонирование генов, выделение ферментов, бактериальная ДНК-метилтрансфераза, специфичность фермента, рестрикционная
эндонуклеаза, чувствительность к метилированию. -
Mapping of R(5mC)GY Sites in the Genome of Human Malignant Cell Line Raji // Biol Med (Aligarh) Volume 7, Issue 4, BM-135-15 (2015). (На английском)
Аннотация
Целью данного исследования была разработка метода широкомасштабного определения метилированных сайтов RCGY в геноме с использованием подхода секвенирования нового поколения (NGS). Мы подвергли гидролизу геномную ДНК человека и злокачественной клеточной линии Raji с помощью метил-направленной сайт-специфической эндонуклеазы GlaI и выделили фрагменты ДНК длиной 140–400 п.н. С помощью технологии NGS на платформе Illumina MiSeq была определена структура ДНК длиной 75 п.н. на обоих концах каждого фрагмента ДНК. Сопоставление полученных последовательностей с эталонным геномом человека позволило определить положения более одного миллиона сайтов R(5mC)GY, представленных в геноме Raji с относительно высокой частотой. Эти данные были сопоставлены с результатами исследования метилирования регуляторных областей генов-супрессоров опухолей, проведенного ранее с использованием новой версии ПЦР-анализа. Мы пришли к выводу, что предложенный метод определения сайтов R(5mC)GY в масштабе всего генома может быть использован для эпигенетических исследований, в частности для определения метилирования регуляторных участков генов, что может влиять на экспрессию генов.
-
Разработка и апробация физико-химических методов в экологических исследованиях // Вода: химия и экология, № 10(76) ,с. 119-122 (2014).
Аннотация
Разработан комплексный подход использования физико-химических методов при решении экологических задач. Представлены результаты поиска индикаторов антропогенного влияния. Выявлено, что в прибрежной части экосистемы оз. Байкал наблюдается качественное изменение микроорганизмов по наличию или отсутствию в них ферментов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз ЭР). Применение этого метода позволит значительно повысить надежность индикации антропогенного загрязнения водных экосистем на ранней стадии
-
Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК // Патент на изобретение RU 2525710 С1 (2014).
Аннотация
Изобретение относится к биотехнологии. Предложенный способ предусматривает получение образцов высокоочищенной ДНК, фрагментацию выделенной ДНК эндонуклеазой рестрикции, не имеющей сайта узнавания в амплифицируемом районе, гидролиз фрагментированной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI или ее изошизомером, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера к гидролизованной ДНК с последующей амплификацией в реальном времени с использованием праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 3' конец которого комплементарен не менее 3 нуклеотидам 3' конца ДНК у исследуемого места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности, и составление заключения на основании флуоресцентного сигнала о наличии последовательности Pu(5mC)GPy.
-
Рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i // Патент на изобретение RU 2529362 С1 (2014).
-
Разработка простого метода получения высокоочищенной ДНК, связанной с клетками крови // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2014. – Т. 13. – № 4. – С. 50–55.
Аннотация
Предложен новый метод очистки ДНК, связанной с клетками крови. Метод позволяет получить высокоочищенный препарат ДНК, пригодный для диагностики с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, в течение одного дня. Метод не требует использования дорогостоящих реагентов, а количество ДНК в получаемых препаратах выше, чем при выделении другими методами.
-
Medium-sized tandem repeats represent an abundant component of the Drosophila virilis genome // BMC Genomics.2013, 14:771. (На английском)
Аннотация
[ПЕРЕВОД] Введение. Ранее нами был разработан простой метод проведения in silico анализа эукариотической ДНК с использованием эндонуклеаз рестрикции на основе известных нуклеотидных последовательностей геномов. Этот метод позволяет рассчитывать длины всех фрагментов ДНК, образующихся при полном гидролизе генома по теоретическим сайтам узнавания выбранной эндонуклеазы рестрикции. Сравнение наблюдаемых пиков на диаграммах распределения длин фрагментов с результатами гидролиза ДНК несколькими эндонуклеазами рестрикции in vitro показало хорошее соответствие между теоретическими и экспериментальными данными в ряде случаев. В настоящей работе данный подход был применён к аннотированному геному Drosophila virilis, который чрезвычайно богат различными повторяющимися последовательностями.
Результаты. Использование комбинированного подхода для рестрикционного анализа ДНК D. virilis позволило выявить три высокопредставленных семейства тандемных повторов средней длины. Если повторы длиной 225 п.н. ранее были обнаружены в межгенных нетранскрибируемых спейсерах между генами рибосомной РНК D. virilis, то два других семейства, состоящие из повторов длиной 154 и 172 п.н., ранее не были описаны. Анализ с использованием программы Tandem Repeats Finder показал, что повторы длиной 154 и 172 п.н. организованы в виде многочисленных кластеров в геноме D. virilis. При этом транскрибируются только повторы длиной 154 п.н., происходящие от транспозона Helitron.
Заключение. Использование in silico гидролиза в сочетании с классическим рестрикционным анализом и секвенированием повторяющихся фрагментов ДНК позволило выделить и охарактеризовать три высокопредставленных семейства повторов средней длины, присутствующих в геноме D. virilis. Эти повторы составляют значительную часть генома и, вероятно, играют важную роль в его функционировании и поддержании структурной целостности. Таким образом, продемонстрирован подход, позволяющий детально исследовать организацию и экспрессию повторов средней длины на основе данных секвенирования даже в случае неполностью собранных и/или недостаточно аннотированных геномов. -
Субстратная специфичность и свойства метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз. // Молекулярная биология, том 47, № 6, с. 900–913(2013).
Аннотация
Метилзависимые сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы (МД-эндонуклеазы) — это немногочисленная группа ферментов, которые специфически расщепляют только метилированную ДНК. Среди них различают ферменты, зависимые от N6-метиладенина и 5-метилцитозина. МД-эндонуклеазы изучены недостаточно, однако представляют значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и с точки зрения практического применения в биотехнологии и эпигеномике. В настоящем обзоре впервые обобщены сведения о свойствах МД-эндонуклеаз, прежде всего об их субстратной специфичности. Кроме того, рассматриваются вопросы участия МД-эндонуклеаз в функционировании бактериальной клетки, а также перспективы их практического использования в биотехнологии и эпигеномике.
-
MteI-ПЦР-анализ-новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 3 ,с. 15-23 (2013).
Аннотация
Предложен новый метод MteI-ПЦР-анализа GC-богатых участков ДНК, основанный на уникальной метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазе MteI, имеющей протяженный высокометилированный сайт узнавания. Метод включает гидролиз ДНК ферментом MteI с последующим проведением ПЦР либо в реальном времени, либо с определением полученных продуктов метод гель-электрофореза. Установлен статус метилирования регуляторных участков ряда генов-онкосупрессоров методом MteI-ПЦР-анализа в сравнении с ранее предложенным методом BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа. Показана применимость метода MteI-ПЦР-анализа для анализа статуса метилирования регуляторных участков генов CEBPD, HS3ST2, RASSF1A, SEPT9b и TWIST1. В случае гена RASSF1A real-time MteI-ПЦР анализ, в отличие от real-time GlaI- и BlsI-ПЦР анализа, не показывает метилирования данного участка ДНК в контрольных здоровых клетках линии фибробластов легких. Таким образом, MteI-ПЦР анализ позволяет более четко определять и дискриминировать статус метилирования регуляторного участка гена RASSF1A и, вероятно, других GC-богатых участков ДНК человека.
-
Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus pumilus N4 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, т. 9, № 3, с. 40-47 (2013).
Аннотация
ДНК бактериального штамма Bacillus pumilus N4, несущего систему рестрикции-модификации BpuN4I (сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’), гидролизовалась эндонуклеазами рестрикции MfeI и EcoRI и полученные продукты клонировались в вектор pUC19, линеаризованный EcoRI. Для отбора клонов, несущих ген эндонуклеазы рестрикции BpuN4I, было предложено использовать метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. С помощью данного метода был выявлен рекомбинантный штамм E. coli N41(pBpuN4/MR), являющийся продуцентом фермента BpuN4I. Также была проведена селекция полученной библиотеки традиционным методом Венецианера и получены два различных клона, один из которых идентичен E. coli N41(pBpuN4/MR), а второй, E. coli N7(pBpuN4/MR), содержит вставку в плазмиде в противоположном направлении и проявляет меньшую активность. Была установлена структура ДНК плазмидной вставки штамма E.coli N41(pBpuN4/M)R и показано, что она содержит гены ДНК-метилтрансферазы M.BpuN4I и эндонуклеазы рестрикции BpuN4I. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ферментов, кодируемых данными генами, выявил гомологию M.BpuN4I с другими метилазами, узнающими сайт 5’-GGNNCC-3’ или сходный с ним. В аминокислотной последовательности M.BpuN4I выявлены все домены, характерные для 5мС-ДНК-метилтрансфераз.
-
Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает и расщепляет последовательность ДНК 5`-G^GNNCC- 3`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 5-8 (2013).
Аннотация
Из бактериального штамм Bacillus pumilus N4 выделена новая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I, определена ее субстратная специфичность и место расщепления ДНК. Эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает последовательность ДНК 5’-G↓GNNCC-3’ и расщепляет ее как указано стрелкой. Фермент, расщепляющий сайт 5’-GGNNCC-3’ с образованием четырехнуклеотидных 5'-липких концов, обнаружен впервые. Рестриктаза BpuN4I является неошизомером фермента NlaIV, имеющего такую же последовательность узнавания, но образующего фрагменты ДНК с тупыми концами.
-
Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5` -RYNRY- 3` при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38 (2013).
Аннотация
Изучена субстратная специфичность метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BlsI. Показано, что BlsI гидролизует вырожденную последовательность ДНК 5’-RYNRY-3’ (где R – A или G, а Y – T или C) при наличии в ней двух или более 5-метилцитозинов. Эффективность гидролиза ДНК ферментом зависит от числа 5-метилцитозинов и их положения в узнаваемой последовательности. Поскольку эндонуклеаза BlsI расщепляет только С5-метилированную ДНК, она может быть использована в молекулярно-биологических и эпигенетических исследованиях для оценки метилирования геномной ДНК эукариот.
-
Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI расщепляет девятинуклеотидную последовательность 5`-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3`/3`-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 8 , № 1 ,с. 16-26 (2012).
Аннотация
Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI выделена из штамма бактерии Microbacterium testaceum 17B. Фермент узнает С5-метилированную последовательность ДНК и не гидролизует неметилированную ДНК. MteI является первой из метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, узнающих протяженный сайт, при этом активность фермента зависит от числа 5-метилцитозинов и их положения в узнаваемой последовательности. MteI расщепляет сайт 5’-G(5mC)G(5mC)↑NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN↓(5mC)G(5mC)G-5’ как указано стрелками и эта последовательность является минимальным сайтом узнавания. Активность фермента существенно возрастает при замене в минимальном сайте узнавания 5’-GC-3’ динуклеотидов на 5’-G(5mC)-3’ динуклеотиды и появлении дополнительных 5’-G(5mC)-3’ динуклеотидов на 5'-концах нонануклеотида в обеих цепях ДНК. Благодаря своей способности расщеплять только протяженные метилированные последовательности ДНК фермент MteI может найти практическое применение в молекулярно-биологических и эпигенетических работах.
-
ДНК-метилтрансфераза M.BssECI образует 5`-m4CCNNGG-3`. Чувствительность эндонуклеаз рестрикции к новому метилированию. // Биотехнология, № 2, с. 32-42 (2012).
Аннотация
Из клеток Bacillus stearothermophilus EC была выделена и очищена ДНК-метилтрансфераза M.BssECI, которая метилирует внешний остаток цитозина в последовательности 5′-CCNNGG-3′ с образованием N4-метилцитозина (5′-m4CCNNGG-3′).
Описаны методы выделения и очистки фермента, включающие гель-фильтрацию на Biogel A-0.5m с последующей хроматографией на бензил-ДЭАЭ-целлюлозе и гепарин-сефарозе, а также метод идентификации метилируемой последовательности ДНК. Оптимальные условия реакции и активность ДНК-метилтрансферазы определяли по способности фермента защищать ДНК фага λ от расщепления эндонуклеазой рестрикции BssECI.
Положение метилируемого основания в сайте узнавания определяли с использованием олигонуклеотидного дуплекса, меченного [^3H]. Специфичность M.BssECI изучали с использованием «самометилированной» ДНК аденовируса 2, данных о чувствительности эндонуклеаз рестрикции BssECI, MvaI и MspI к метилированной ДНК, а также методов компьютерного моделирования.
Выделенный фермент может быть использован для исследования характера метилирования ДНК. В частности, предложенный подход позволяет различать N4-метилцитозин (m4C) и 5-метилцитозин (m5C). ДНК бактериофагов λ и T7, метилированную M.BssECI, использовали для изучения чувствительности ряда эндонуклеаз рестрикции к метилированию их сайтов узнавания. -
Новая ДНК-метилтрансфераза M.BstC8I образует 5`-G(m5C)NNGC-3`.Изучение чувствительности эндонуклез рестрикции к M.BstС8I–метилированию. // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. № 1. с.35-40 (2012).
Аннотация
Новая ДНК-метилтрансфераза M.BstC8I была обнаружена в клеточном лизате Bacillus stearothermophilus C8, выращенного на агаре Луриа при 37°C. Метилирование ДНК бактериофагов λ и T7 по последовательности 5′-G(5mC)NNGC-3′ блокировало активность эндонуклеазы рестрикции BstC8I. Специфичность M.BstC8I определяли с использованием метилированной ею ДНК фага λ, компьютерного моделирования и данных о чувствительности эндонуклеаз рестрикции BstC8I, BsuRI, AjnI и PvuII к метилированию. Показана чувствительность ряда эндонуклеаз рестрикции к перекрыванию их сайтов узнавания новым типом метилирования. Полученные результаты могут быть использованы для изучения метилирования ДНК.
-
Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 3 ,с. 5-16 (2011).
Аннотация
Метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа был использован для определения статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров SEPT9b, IGFBP3, CEBPD, MGMT и RASSF1A в ДНК малигнантных клеточных линий HeLa, Raji, U-937 и Jurkat, а также в контрольной ДНК клеточной линии фибробластов L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР анализ показал, что регуляторные области генов-онкосупрессоров RASSF1A, SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT могут как содержать метилированные последовательности 5’-R(5mC)GY-3’, так и не иметь этих сайтов в зависимости от малигнантной клеточной линии, из которой выделялась ДНК. В ДНК исследованных клеточных линий наблюдались различные комбинации генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами. При этом в здоровых клетках линии фибробластов L-68 не было обнаружено сайтов 5’-R(5mC)GY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей. На основе полученных результатов предлагается применять BlsI- и GlaI-ПЦР анализ для эпигенетического типирования малигнантных клеточных линий.
-
Новая метил-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5`-G^C(5mC)GGC-3`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 1 ,с. 14-20 (2011).
Аннотация
Выделена новая 5-метилцитозин-зависимая сайт-специфическая ДНК эндонуклеаза KroI из Kocuria rosea 307, узнающая и расщепляющая последовательность ДНК 5'-G↑CCGGC-3'/3'-CGGCC↑G-5' при наличии в центральном динуклеотиде и его комплементе 5'-CG-3'/3'-GC-5' одного или двух 5-метилцитозинов. КroI не гидролизует неметилированную ДНК, а также метилированные последовательности 5'-G(5mC)CGGC-3'/3'-CGGC(5mC)G-5' и 5'-G(5mC)CGG(5mC)-3'/3'-(5mC)GGC(5mC)G-5'. KroI является первой сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазой, узнающей невырожденную шестинуклеотидную последовательность. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК фермент KroI может найти практическое применение в молекулярно-биологических работах, в частности, для определения статуса метилирования ДНК эукариот.
-
Сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза FaiI узнает вырожденную четырехнуклеотидную последовательность 5`-YA^TR-3`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 2 ,с. 11-16 (2011).
Аннотация
Изучена субстратная специфичность новой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы FaiI, которая узнает и расщепляет последовательность 5’-YA↑TR-3’, а также гидролизует с меньшей активностью сайт 5’-YA↑TY. При замене в последовательности узнавания одного из центральных AT нуклеотидов, фермент проявляет никазную активность, причем расщепляется та цепь сайта узнавания, в которой сохраняется тимин. FaiI расщепляет ДНК, содержащую в сайте узнавания 5-метилцитозин, N4-метилцитозин и N6-метиладенин. Ключевые слова: сайт-специфическая эндонуклеаза, вырожденная последовательность узнавания, мелкощепящая эндонуклеаза.
-
Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5`-GCN^GC-3`/3`-CG^NCG-5`, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 3 ,с. 35-42 (2011).
Аннотация
Из штамма бактерии Planomicrobium koreense 78k выделена новая сайт-специфическая метилзависимая
ДНК эндонуклеаза PkrI, узнающая и расщепляющая как указано стрелкой метилированную
последовательность ДНК 5'-GCN↑GC-3’/3’-CG↓NCG-5’ при наличии в ней не менее трёх 5-метилцитозинов и
не расщепляющая неметилированную ДНК. Благодаря своей способности расщеплять только
метилированную ДНК фермент PkrI может найти практическое применение в молекулярно-биологических
работах, в частности, для определения статуса метилирования ДНК эукариот. -
Клонирование и анализ биохимических и кинетических свойств ДНК-метилтрансферазы M1.BspACI. // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. № 2. С. 38-40 (2011).
Аннотация
Гены ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC были клонированы в клетках E. coli. Анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых этими генами, показал, что оба фермента относятся к классу C5 ДНК-метилтрансфераз. Ген M1.BspACI был субклонирован в составе экспрессирующего вектора pJW2.
Препарат высокоочищенного рекомбинантного фермента получали с использованием хроматографии на различных носителях. Установлено, что M1.BspACI модифицирует первый цитозин в последовательности 5′-CCGC-3′. Определены кинетические параметры реакции метилирования ДНК этим ферментом. Показано, что каталитическая константа составляет 0,095 ± 0,002 мин⁻¹, Km для ДНК фага λ — 0,053 ± 0,007 мкМ, а Km для S-аденозил-L-метионина (SAM) — 5,1 ± 0,3 мкМ. -
Штамм бактерий Microbacterium testaceum 17B - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы MteI. // Патент на изобретение RU 2475533 С1 (2011).
-
Штамм бактерий Planomicrobium koreense 78K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы PkrI. // Патент на изобретение RU 2475534 С1 (2011).
-
Субстратная специфичность и биохимические свойства ДНК-метилтрансферазы M3.BstF5I из системы рестрикции-модификации BstF5I. // Биохимия, т. 75, вып.1 (2010) с.78-87.
Аннотация
Определены оптимальные условия метилирования ДНК ферментом M3.BstF5I из Bacillus stearothermophilus и установлены кинетические параметры реакции модификации ДНК бактериофага λ и ряда олигонуклеотидных субстратов.
Сравнение кинетических параметров M1.BstF5I и M3.BstF5I показало, что при сходных температурных оптимумах и сродстве к ДНК фермент M3.BstF5I в оптимальных условиях характеризуется примерно в четыре раза меньшим числом оборотов (0,24 мин⁻¹) и модифицирует полуметилированный сайт узнавания менее эффективно, чем неметилированный.
В отличие от трех других ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции–модификации BstF5I, фермент M3.BstF5I способен дополнительно метилировать неканоническую последовательность ДНК 5′-GGATC-3′, однако скорость этой реакции более чем на порядок ниже скорости метилирования канонического сайта узнавания 5′-GGATG-3′. -
Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза M1.Bst19I из Bacillus stearothermophilus 19: получение, свойства и сравнительный анализ аминокислотной последовательности. // Молекулярная биология, т. 44, №4, с.688-698 (2010).
Аннотация
Ген ДНК-метилтрансферазы M1.Bst19I системы рестрикции–модификации Bst19I (сайт узнавания 5′-GCATC-3′) из штамма Bacillus stearothermophilus 19 был клонирован в составе экспрессионного вектора pJW, содержащего тандем термоиндуцибельных промоторов PR/PL бактериофага λ.
Высокоочищенный препарат фермента был получен из биомассы клеток Escherichia coli, в которых фермент накапливался в растворимой форме, с использованием последовательной хроматографии на различных сорбентах.
Фермент M1.Bst19I имеет температурный оптимум 50°C и проявляет максимальную активность при pH 8.0. Он метилирует остаток аденина в последовательности 5′-GCATC-3′. Определены кинетические параметры реакции метилирования ДНК ферментом M1.Bst19I. Константа Михаэлиса (Km) для ДНК бактериофага λ составила 0.68 ± 0.07 мкМ, а для S-аденозил-L-метионина — 2.02 ± 0.31 мкМ. Значение каталитической константы (kcat) составило 1.8 ± 0.05 мин⁻¹.
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей домена распознавания субстрата M1.Bst19I и других N6-адениновых ДНК-метилтрансфераз позволил предположить существование двух типов ферментов, распознающих последовательности, содержащие триплет ATG или ATC. -
Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза M1.BspACI из Bacilluspsychrodurans AC: получение и свойства // Биохимия, 2010, т. 75, вып.12, с. 1712-1719.
Аннотация
Система рестрикции-модификации Bacillus psychrodurans AC (сайт узнавания 5′-CCGC-3′) содержит две ДНК-метилтрансферазы: M1.BspACI и M2.BspACI. Ген bspACIM1 клонировали в составе вектора pJW2 и экспрессировали в клетках Escherichia coli. Высокоочищенный препарат фермента M1.BspACI получили путем очистки в пять хроматографических стадий. M1.BspACI проявляет максимальную активность при 30°C, pH 8. Фермент модифицирует первый остаток цитозина в последовательности узнавания 5′-CCGC-3′. Каталитическая константа реакции метилирования ДНК ферментом M1.BspACI равна 0,095 мин⁻¹, Km для ДНК фага λ — 0,053 мкМ, Km для S-аденозил-L-метионина — 5,1 мкМ.
-
BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 6 , № 1 ,с. 5-12 (2010).
Аннотация
На основе уникальных метилзависимых сайт-специфических ДНК эндонуклеаз предложен новый метод BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа метилированных участков ДНК. Метод включает обработку ДНК ферментами BlsI или GlaI, соответственно, с последующим ПЦР-анализом полученных гидролизатов. На примере изучения метилирования регуляторных областей ряда генов-онкосупрессоров человека показана эффективность нового метода и соответствие получаемых с его помощью результатов данным бисульфитного секвенирования ДНК. Исследование метилирования промоторной области гена DAPK1, района промотора и первого экзона гена RARB и области первого экзона гена RASSF1A новым методом выявило различные картины метилирования этих участков ДНК в клеточных линиях HeLa, Raji, U-937, Jurkat и контрольных клетках L-68. GlaI-ПЦР-анализ определил метилирование регуляторной области гена RARB в ДНК всех малигнантных клеточных линий и отсутствие этой модификации в ДНК клеток L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР-анализ района первого экзона гена RASSF1A показал наличие метилированных участков ДНК только в клетках Raji и Jurkat. BlsI-ПЦР-анализ промоторной области гена DAPK1 продемонстрировал дополнительное метилирование этого участка ДНК только в клетках Raji. Обсуждаются возможности использования BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа для выявления малигнантных клеток и определения типа онкопатологии.
-
Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза M2.BstSEI из никазно-метилазной системы NM.BstSEI: получение и свойства. // Молекулярная биология, т.43, № 1, 10-18 (2009).
-
GlaI digestion of mouse γ-satellite DNA: study of primary structure and ACGT sites methylation // BMC Genomics 2009, 10:322. (На английском)
Аннотация
Характеристики гидролиза ДНК мыши с помощью рестриктаз совпадают с расчётными диаграммами расщепления геномной ДНК, полученными in silico, за исключением наличия дополнительных ярких полос, которые соответствуют мономеру и димеру γ-сателлитной ДНК. В базах данных представлена лишь небольшая часть последовательностей γ-сателлитной ДНК мыши. Метил-направленная эндонуклеаза GlaI расщепляет ДНК мыши и может быть полезна для детального изучения первичной структуры и метилирования динуклеотидов CG в γ-сателлитной ДНК.
-
Новая сайт-специфическая эндонуклеаза BspACI из BACILLUS PSYCHRODURANS AC узнает последовательность 5`-C^CGC-3`/3`-GGC^G-5`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т5, №1, С. 16-24 (2009).
-
Определение специфичности ДНК-метилтрансферазы M.Bsc4I в клеточном лизате при помощи блокирования эндонуклеаз рестрикции и компьютерного моделирования // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол., № 3, С. 3-8 (2009).
Аннотация
В клеточном лизате Bacillus schlegelii 4 определяли специфичность ДНК-метилтрансферазы М. Bsc4I. Для этого использовали чувствительность эндонуклеаз рестрикции к метилированию, а также моделирование метилирования. Моделирование заключалось в редактировании последовательностей ДНК путем замен метилируемых и комплементарных им оснований. Субстратные ДНК, обработанные М. Bsc4I, использовали для изучения чувствиельности ряда рестриктаз к метилированию. При этом было показано, что М. Bsc4I метилировала 5-Cm4CNNNNNNNGG-3, а перекрывающееся dcm-метилирование блокировало ее активность. Предлагаемый подход может оказаться достаточно универсальным и простым при определении специфичности ДНК-метилтрансфераз.
-
Определение специфичности ДНК-метилтрансферазы M.AspS9I в клеточном лизате при помощи блокирования эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология, № 4, С.30-39 (2009).
-
Штамм бактерии Kocuria rosea - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы KroI. // Патент на изобретение RU 2394099 С1 (2009).
-
Способ определения гиперметилированных CpG островков в области генов-супрессоров опухолевого роста в ДНК человека. // Патент на изобретение RU 2413773 С1 (2009).
-
Штамм бактерии Arthrobacter oxydans - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы AoxI. // Патент на изобретение RU 2399663 С1 (2009).
-
Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI . // BMC Molecular Biology 2008, 9:7. (На английском)
Аннотация
Недавно нам удалось обнаружить сайт-специфические эндонуклеазы, которые распознают и расщепляют только те последовательности ДНК, в которых присутствует 5-метилцитозин. Описаны два вида таких эндонуклеаз. Ферменты BisI, BlsI и GluI являются изошизомерами и гидролизуют последовательность ДНК 5'-GCNGC-3'/3'-CGNCG-5', метилированную по-разному. Фермент GlaI расщепляет последовательность ДНК 5'-GCGC-3'/3'-CGCG-5', если в ней присутствуют два, три или четыре 5-метилцитозина. Цель настоящей работы — детально изучить состав распознавательной последовательности и влияние метилированных цитозинов на эффективность расщепления ДНК метил-направленной ДНК-эндонуклеазой GlaI.
-
Физическая карта расщепления эндонуклеазами рестрикции Alu повторов человека // BMC Genomics 2008, 9:305. (На английском)
Аннотация
Повторяющиеся элементы Alu представляют собой наиболее распространенные последовательности в геноме человека. Разнообразие ДНК-последовательностей этих элементов затрудняет построение теоретических моделей расщепления повторов Alu рестрикционными эндонуклеазами. Мы предложили метод рестрикционного анализа последовательностей повторов Alu in silico.
-
Новая эндонуклеаза рестрикции GsaI, неошизомер фермента BseY I, узнает последовательность ДНК 5’-CCCAGC(-1/-5)-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т4, №1, С. 19-24 (2008).
-
Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2008).
-
Новая эндонуклеаза рестрикции AluBI из Arthrobacter luteus B- изошизомер AluI, нечувствительный к присутствию 5-метилцитозина в сайте узнавания AGCT. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т3, №1, С. 21-27 (2007).
Аннотация
Описаны свойства новой эндонуклеазы рестрикции, AluBI, узнающей и расщепляющей последовательность AGCT и являющейся изошизомером хорошо известной рестриктазы AluI. Фермент AluBI, в отличие от AluI, расщепляет ДНК в случае, когда цитозиновые основания в сайте узнавания метилированы в положение С5. AluBI также расщепляет последовательность узнавания с одним С5-метилированным и другим N4-метилированным цитозинами, однако не расщепляет ДНК при модификации обоих цитозинов в положение N4.
-
Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т3, №1, С. 28-33 (2007).
Аннотация
Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Bacillus simplex 23, продуцент сайт-специфической эндонуклеазы BlsI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)N↑GC-3’, как и обнаруженная ранее сайт-специфическая эндонуклеаза BisI (сайт узнавания 5’-G(5mC)↑NGC-3’), но, в отличие от последней, расщепляет ДНК с образованием однонуклеотидных 3’-выступающих концов. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК фермент BlsI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот.
-
Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т3, №2, С. 13-17 (2007).
Аннотация
Из бактериального штамма Glacial ice bacterium GL24 была выделена и охарактеризована новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’ расщепляет ее, как указано стрелкой. Благодаря своей способности расщеплять только высокометилированную ДНК фермент GluI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот.
-
Система рестрикции-модификации Sse9I: организация генов и сравнительный анализ структуры белков . // Молекулярная биология, т.41, №3, с. 491-498 (2007).
-
Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007).
-
Рестрикционный анализ ДНК человека – новые возможности в ДНК-диагностике // Медицинская генетика, Т.6, № 8, с 29-36 (2007).
Аннотация
Изучены возможности использования метода расщепления хромосомной ДНК человека эндонуклеазами рестрикции в работах по медицинской генетике. На основе ранее опубликованной работы по анализу геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК человека при ее расщеплении по 15 нуклеотидным последовательностям, которые являются сайтами узнавания рестриктаз. Проведен анализ первичной структуры Alu- и LINE1-повторов ДНК и построены диаграммы распределения фрагментов ДНК повторов при ее расщеплении по этим 15 нуклеотидным последовательностям. При этом показано, что диаграммы распределения получаемых низкомолекулярных фрагментов хромосомной ДНК соответствуют диаграммам распределения фрагментов Alu-повторов, тогда как картины распределения высокомолекулярных фрагментов аналогичны диаграммам распределения LINE1-повторов. Получены картины гидролиза ДНК человека соответствующими эндонуклеазами рестрикции и проведено сравнение теоретических диаграмм распределения фрагментов и экспериментально полученных результатов. Обсуждаются перспективы применения сайт-специфических эндонуклеаз в ДНК-диагностике.
-
Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
Аннотация
На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК мыши при ее расщеплении по 18 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Проведен анализ имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей LINE1 повторов мыши и фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении этих повторов. Установлено, что абсолютное большинство пиков на диаграммах расщепления хромосомной ДНК соответствуют аналогичным пикам, образуемым при расщеплении множества LINE1 повторов ДНК мыши по тем же нуклеотидным последовательностям. Получены экспериментальные картины гидролиза ДНК мыши соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и полученных картин гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции. Показано, что при анализе препаратов ДНК с помощью электрофореза в геле визуализируются только продукты расщепления LINE1-повторов и γ-сателлитной ДНК мыши. Проделаны эксперименты по гидролизу хромосомной ДНК мыши 5-метилцитозин-зависимыми сайт-специфическими эндонуклеазами BlsI, GlaI и GluI.
-
Штамм бактерий Arthrobacter luteus B - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы AluBI // Патент на изобретение RU 2340670 С1 (2007).
-
Субстратная специфичность новой рестриктазы SetI // Биотехнология и биоинженерия: материалы конференции (2006)
Аннотация
В настоящее время известно лишь несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих короткие вырожденные последовательности ДНК длиной 3–4 нуклеотида. К ним относятся эндонуклеаза рестрикции CviJI и ее различные изошизомеры, выделенные из эукариотического вируса Chlorella, которые узнают и расщепляют последовательность 5′-RGCY-3′ [1]. В настоящей работе описана субстратная специфичность новой сайт-специфической эндонуклеазы SetI, способной расщеплять последовательность ДНК 5′-ASST^-3′ (четыре основные последовательности: ACGT^, AGCT^, ACCT^ и AGGT^). Эндонуклеаза SetI была выделена из штамма Escherichia coli, несущего клонированный ген SetI из Streptomyces werraensis 37.
-
BstKTI - новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный гидролизовать полуметилированный субстрат. // Биотехнология, №2, с. 5-10 (2006).
Аннотация
Обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus KT, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции BstKTI, которая является неошизомером рестриктазы MboI, узнающей последовательность 5’-↑GATC-3’. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Показано, что гидролиз ДНК осуществляется в положении 5’-GAT↑C-3’. В отличии от других изошизомеров рестриктазы MboI, BstKTI является чувствительным к dam-метилированию, но способен расщеплять полуметилированный по аденину субстрат. Кроме того, BstKTI гидролизует сайт 5’-GATC-3’, в котором цитозин модифицирован в положении С5.
-
Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5′-G(5mC)^GC-3′. // Биотехнология, №4, С.31-35 (2006).
Аннотация
Из бактериального штамма GL29 была выделена и охарактеризована новая эндонуклеаза рестрикции GlaI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓GC-3’ и расщепляет ее, как указано стрелкой. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК GlaI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот.
-
Новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI из Arthrobacter species 7М06 узнает октануклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова,Т2, №2, С.29-34 (2006).
Аннотация
Обнаружен бактериальный штамм Arthrobacter species 7М06, который является продуцентом новой сайт-специфической эндонуклеазы AbsI. Фермент AbsI узнает палиндромную октануклеотидную последовательность ДНК 5’-CC↑TCGAGG-3’ и гидролизует ее после второго цитозина, образуя, таким образом, 5’-выступающие «липкие» концы, которые совместимы с концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’), PspXI (5’-VC↑TCGAGB-3’) и SalI (5’-G↑TCGAC-3’). Среди всех известных редкощепящих эндонуклеаз рестрикции AbsI является единственным ферментом, не имеющим сайтов узнавания на стандартных субстратов, таких как ДНК фагов лямбда и Т7, а также аденовирусной ДНК типа 2.
-
Штамм бактерий Bacillus simplex - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bls I // Патент на изобретение RU 2322494 С1 (2006).
-
Штамм бактерий Glacial ice bacterium - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Glu I // Патент на изобретение RU 2322492 С1 (2006).
-
Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5′-GCGC-3′. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, т.2, №1 (2006) с. 30-39.
Аннотация
Изучена зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI, узнающей и гидролизующей метилированную последовательность ДНК 5’-GCGC-3’/3’-CGCG-5’, от количества и положения метилированных по 5-ому положению цитозиновых остатков в последовательности узнавания. Существенный гидролиз ДНК происходит только в том случае, если в сайте узнавания модифицировано от двух до четырех оснований, причем в первом случае оба метилцитозина должны быть внутренними. Эффективность расщепления субстрата возрастает с увеличением количества метилированных оснований и максимальна, когда в сайте узнавания модифицированы все четыре цитозина. GlaI расщепляет сайты, содержащие 5-метилцитозины, но не N4-метилцитозины.
-
Метод рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т. 2 №3. – С. 29-38 (2006).
Аннотация
Предложен метод получения теоретических картин расщепления хромосомной ДНК млекопитающих эндонуклеазами рестрикции. Основываясь на опубликованных в последнее время данных по первичной структуре геномов, проведен расчет и построены диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК мыши, крысы и человека, полученных при расщеплении по последовательностям 5’-GGCC-3', 5'-CCGG-3', 5'-GATC-3' и 5'-CC(A/T)GG-3'. Проделаны эксперименты по гидролизу хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции HaeIII, MspI, Kzo9I и Bst2UI, имеющими соответствующие сайты узнавания, и показано соответствие между рассчитанными диаграммами и экспериментально полученными картинами рестрикции ДНК.
-
Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т. 2 №3. – С. 39-46 (2006).
Аннотация
На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК крысы при ее расщеплении по более чем 25 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. При проведении рестрикционного анализа in vitro получены картины электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях продуктов гидролиза ДНК крысы всеми этими ферментами. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и экспериментально полученных данных по гидролизу ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции.
-
Использование рестрикционного анализа амплифицированного гена 16S РНК для идентификации микроорганизмов на примере бактериальных продуцентов термолабильной щелочной фосфатазы // Биотехнология, №6. – С. 3-11 (2005).
Аннотация
Предложен метод идентификации микроорганизмов, основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ПЦР-продукта гена 16S РНК длиной 1500 нуклеотидов. Подобран набор из 6 эндонуклеаз рестрикции (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI и RsaI), позволяющий с помощью ПДФР проводить идентификацию широкого спектра микроорганизмов.
Из природных изолятов морской воды выделены четыре штамма-продуцента термолабильной щелочной фосфатазы. Проведенный анализ ПДФР для данных штаммов в сравнении с расчетными результатами, полученными для генов 16S РНК различных микроорганизмов, позволил установить, что выявленные продуценты относятся к роду Alteromonas. -
Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2. // Биотехнология, №2, С. 38-43 (2005).
Аннотация
Из природных изолятов нами был выделен продуцент термолабильной щелочной фосфатазы, идентифицированной как вид бактерии Alteromonas undina P2. Описан способ очистки фермента. Определены оптимальные условия действия щелочной фосфатазы: 0.1 М глицин-NaOH pH 9.5, 10 мМ MgCl₂ и 0.1 мМ ZnCl₂. Фермент наиболее активен при 30°C. При 6°C уровень активности щелочной фосфатазы превышает 50% от максимальной. Прогревание ферментного препарата в течение 20 мин при 65° приводит к полной необратимой инактивации фосфатазы.
-
Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)^NGC-3′. // Биотехнология, №3, С. 22-26 (2005).
Аннотация
Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Bacillus subtilis Т30, продуцент новой эндонуклеазы рестрикции Bis I. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓NGC-3’ и расщепляет ее, как указано стрелкой. Вследствие расщепления только модифицированной ДНК, фермент Bis I может найти широкое применение для определения метилированных участков на эукариотической ДНК.
-
Новая эндонуклеаза рестрикции PspXI узнает необычную последовательность ДНК 5′-VC^TCGAGB-3′. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, №1, С. 18-23 (2005).
Аннотация
Нами обнаружен бактериальный штамм Pseudomonas species X11, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PspXI. Этот фермент узнает восьминуклеотидную последовательность ДНК с необычным, V-B типом вырожденности: 5’-VCTCGAGB-3’, где V означает A, C или G, а B означает T, C или G. Препарат эндонуклеазы рестрикции PspXI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Показано, что PspXI гидролизует сайт узнавания между C и T, с образованием 5’-выступающих “липких” концов, совместимых с концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’) и SalI (5’-G^TCGAC-3’).
-
Штамм бактерий Glacial ice bacterium I - продуцент эндонуклеазы рестрикции Gla I // Патент на изобретение RU 2287012 С1 (2005).
-
Первичная структура оперона NM.BstSEI из Bacillus stearothermophilus SE-589, продуцента сайт-специфической никазы N.BstSEI. // Молекулярная биология, т. 39, № 6, c. 960-964 (2005).
-
ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной последовательности 5′-CCCGC-3′ (Выделение и свойства). // Биохимия, т. 70, №6 (2005) с.829-837.
Аннотация
Ген ДНК-метилтрансферазы FauIA из системы рестрикции–модификации FauI (сайт узнавания 5'-CCCGC-3') был клонирован в экспрессирующий вектор pJW, который использовался для трансформации клеток E.coli RR1 с последующей термоиндукцией и наработкой биомассы бактериальных клеток. Высоко очищенный препарат ДНКметилтрансферазы – М.FauIA, был получен с помощью хроматографии на различных носителях. Выделенный фермент имеет молекулярный вес ~39 кДа, что соответствует теоретически установленному молекулярному весу соответствующей рамки трансляции. Изучение свойств полученного фермента показало, что М.FauIA имеет температурный оптимум 33° и проявляет максимальную активность при pH 7,5. Метилированием ферментом М.FauIA синтетического олигонуклеотида с последующим расщеплением различными рестриктазами и анализом полученных продуктов установлено, что М.FauIA модифицирует второй цитозин в последовательности 5-'CCCGC3-'. Определены кинетические параметры реакции метилирования синтетического олигонуклеотидного дуплеска ферментом М.FauIA и показано, что константа Михаэлиса (Km) для этого субстрата составляет 0,16 мкМ, Km для S-аденозил-L-метионина (SAM) равно 0,78 мкМ, а значение каталитической константы (kkat) составило 0,05 мин–1.
-
Использование рестрикционного анализа амплифицированного гена 16S РНК для идентификации микроорганизмов на примере бактериальных продуцентов термолабильной щелочной фосфатазы. // Биотехнология, №6, с 3-11 (2005).
-
Эндонуклеаза рестрикции AjnI из Acinetobacter johnsonii R2, изошизомер EcoRII, узнает 5′- ↓CCWGG-3′, но не блокируется dcm-метилированием. // Биотехнология, №3, С. 19-24 (2004).
Аннотация
Из природных изолятов был выделен новый продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктаза названа AjnI. Описан способ очистки и оценки активности фермента. Показано, что рестриктаза AjnI образует фрагменты ДНК с 5’-CCWGG выступающими концами, как и EcoRII, но не блокируется dcm-метилированием. Рестриктаза AjnI может найти широкое применение в генетической инженерии.
-
Штамм бактерий Bacillus subtilis - продуцент эндонуклеазы рестрикции Bis I // Патент на изобретение RU 2270859 С1 (2004).
-
Клонирование, установление первичной структуры и сравнительный анализ ДНК-метилтрансфераз из систем рестрикции-модификации SfaNI и Bst19I. // Молекулярная биология, т. 38, № 6, c. 997-1004 (2004).
-
Определение содержания G + C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции. // Биотехнология, №4, 77-82 (2004).
-
Эндонуклеаза рестрикции BmtI из Bacillus megaterium S2 расщепляет ДНК по 5′-GCTAG^C-3′. // Биотехнология, №1, С. 11-15 (2003).
Аннотация
Обнаружен новый штамм - продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) BmtI, который был идентифицирован как бактериальный вид Bacillus megaterium S2. Описаны схема очистки фермента и некоторые его свойства. Показано, что рестриктаза BmtI является гетерошизомером хорошо известного фермента NheI (расщепляет 5'-G^CTAGC-3') и разрушает ДНК, образуя фрагменты с выступающими CTAG-3'- концами. Рестриктаза BmtI может быть использована в генетической инженерии.
-
Эндонуклеазы рестрикции FalI и FalII из Flavobacterium aquatile узнают 5′-(8/13)AAGN5CTT(13/8)-3′. // Биотехнология, №6, С. 24-29 (2003).
Аннотация
Из водных изолятов нами выделен штамм Flavobacterium aquatile Ob10, который продуцирует две эндонуклеазы рестрикции FalI и FalII. FalI является новым прототипом и узнает последовательность ДНК 5'-(8/13)AAG(N)5CTT(13/8)-3'. Фермент FalI стимулируется S-аденозилметионином и расщепляет ДНК с обеих сторон от узнаваемой последовательности. Таким образом, FalI принадлежит к BcgI-подтипу эндонуклеаз рестрикции. FalII расщепляет ДНК по сайту 5'-CG↓CG-3', являясь, таким образом, изошизомером FnuDII.
-
Уникальная система рестрикции-модификации FauI: клонирование и сравнительный анализ структуры белков. // Молекулярная биология, т. 37, № 4, с. 619-624 (2003).
-
ДНК-Метилтрансферазы M.BstF5I-2 и M.BstF5I-4 системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Биохимия, т. 68, №9 (2003).
-
Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus thermophilus B35: получение и изучение свойств модифицированной формы фермента, обладающей повышенным сродством к ddNTP. // Биохимия, т. 68, №12 (2003).
-
Выделение и характеристика эндонуклеазы I из Proteus vulgaris 84. // Биотехнология, №1, 15-20 (2002).
Аннотация
Фермент с молекулярной массой 33 кД был выделен и очищен более чем в 200 раз. Определены оптимальные условия действия фермента: pH 9,5, 25 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl. Фермент наиболее активен при 37°C. Показано, что выделенный фермент является эндонуклеазой, которая гидролизует нативную и денатурированную нагреванием ДНК и РНК до олигонуклеотидов длиной 3-5 нуклеотидных остатка с 5 -фосфатом на конце.
-
Эндонуклеаза рестрикции FatI из Flavobacterium aquatile NL3 расщепляет ДНК по сайту 5′-^CATG-3′. // Биотехнология, №5, 3-7 (2002).
Аннотация
Новый продуцент эндонуклеазы рестрикции был получен из природных изолятов и идентифицирован как вид бактерии Flavobacterium aquatile NL3, а соответствующая рестриктаза названа FatI. Описаны способ очистки и определение активности фермента. Показано, что рестриктаза FatI образует фрагменты ДНК с 5'-CATG выступающими концами и может найти широкое применение в генетической инженерии.
-
Эндонуклеаза рестрикции Bst19I из штамма Bacillus stearothermophilus, узнающая последовательность ДНК 5′-GCATC-3′. // Биотехнология, №6, 17-20 (2002).
Аннотация
Выделен штамм Bacillus stearothermophilus 19 являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции Bst19I. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая его субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Эндонуклеаза рестрикции Bst19I идентифицирована как гетерошизомер рестриктазы SfaNI, узнающий последовательность 5’-GCATC-3’ и гидролизующий ДНК на расстоянии 4 и 6 нуклеотидов от сайта узнавания на верхней и нижней цепях соответственно.
-
Сравнительное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз M. Bst F5I-1 и M. Bst F5I-3 системы рестиркции-модификации Bst F5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Молекулярная биология, т. 36, № 1 , с. 136-143 (2002).
-
Экспресс-метод тестирования активности фермента репарации урацил-ДНК-гликозилазы. // Биоорганическая химия, т.26, №6, 442-447 (2000).
-
M.BstF5-1, четвертая ДНК-метилтрансфераза системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilius F5. // Биоорганическая химия, вып. 28, с. 84-86 (2002).
-
Новая сайт-специфическая ДНК-никаза N.Bst9I из Bacillus stearothermophilus 9. // Биотехнология, №4, С. 3-8 (2001).
Аннотация
В ходе скрининга бактериальных штаммов, выделенных из природных изолятов, нами обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus 9, продуцирующий новую сайт-специфическую ДНК-никазу, названную N.Bst9I. N.Bst9I узнает и расщепляет в ДНК последовательность 5'-GAGTCNNNN^-3', являясь таким образом изошизомером ранее обнаруженного нами фермента N.BstSEI. Однако ферментативные свойства этих двух ферментов существенно различаются, причем использование N.Bst9I в генно-инженерных и биотехнологических работах предпочтительнее, так как он практически не проявляет дополнительную активность, характерную для N.BstSEI.
-
Эндонуклеаза рестрикции ZraI из Zoogloea ramigera 11 узнает 5′-GAC^GTC-3′. // Биотехнология, №6, 3-7 (2001).
Аннотация
Из природных изолятов нами выделен продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид бактерии Zoogloea ramigera 11, а его рестриктаза была названа ZraI. Описан способ очистки фермента и определения его активности. Показано, что фермент ZraI расщепляет ДНК с образованием тупых концов и может найти широкое применение в генетической инженерии.
-
Btr I, a novel restriction endonuclease, recognizes the non-palindromic sequence 5′-CACGTC-3′ (-3/-3). // Nucleic Acids Research, Vol. 28, No 11.(2000). (На английском)
Аннотация
Определены последовательность распознавания и позиции расщепления новой эндонуклеазы рестрикции BtrI, выделенной из Bacillus stearothermophilus SE-U62. BtrI относится к редкому типу IIQ эндонуклеаз рестрикции, которые распознают непалиндромные нуклеотидные последовательности и симметрично расщепляют ДНК в пределах этих последовательностей.
-
Новая редкощепящая эндонуклеаза рестрикции SmiI из Streptococcus milleri узнает 5′-ATTT^AAAT-3′. // Молекулярная биология и вирусология, №1, 23-27 (2000).
-
Вторая ДНК-метилтрансфераза из системы рестрикции-модификации BstF5I гомологична С-концевым доменам метилаз FokI и StsI. // Молекулярная биология, т.34, №1, 87-94 (2000).
Аннотация
Определена нуклеотидная последовательность гена ДНК-метилтрансферазы М.BstF5I-2, входящей в систему рестрикции-модификации штамма Bacillus stearothermophilus F5. На бактериальной хромосоме ген bstF5IM-2 располагается за геном метилазы М.BstF5I-1 и имеет ту же ориентацию. Кодируемый геном bstF5IM-2 белок содержит консервативные участки, специфичные для адениновых ДНК-метилтрансфераз класса D12. ДНК-метилаза М.BstF5I-2 гомологична С-концевым доменам ДНК-метилаз FokI и StsI, имеющим ту же последовательность узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации BstF5I содержит уникальный фермент М.BstF5I-1, модифицирующий верхнюю цепь узнаваемой последовательности, и М.BstF5I-2, гомологичный С-концевым частям ферментов-изошизомеров М.FokI и М.StsI, модифицирующих вторую цепь ДНК в участке узнавания.
-
Множественность сайт-специфических ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5. // Молекулярная биология, т.34, №3, 443-447 (2000).
Аннотация
Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Bacillus stearothermophilus F5, прилегающего к 3'-концу области, содержащей гены ДНК-метилтрансфераз M.BstF5I-1 и M.BstF5I-2 из системы рестрикции-модификации BstF5I. Выявлен ген, кодирующий белок M.BstF5I-3, структурно и функционально гомологичный N-концевому домену метилазы M.FokI. Таким образом, в отличие от всех известных систем рестрикции-модификации, система BstF5I включает три гена, кодирующих ДНК-метилтрансферазы, две из которых гомологичны двум различным доменам M.FokI.
-
Сравнительный анализ гомологичных сисем рестрикции-модификации SfeI И LlaBI. // Молекулярная биология, т. 36, № 3, с. 432-437 (2002).
Аннотация
Клонирован фрагмент плазмидной ДНК Streptococcus faecalisSE72, содержащий гены системы рестрикции-модификации SfeI. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента выявил высокую гомологию между оперонами систем SfeI и LlaBI из Lactococcus lactis subsp. cremoris W56 (99.2%) с тем же участком узнавания 5-CTRYAG-3'. Существенными отличиями системы SfeI от LlaBI являются дополнительный фрагмент длиной 198 п.н. в гене ДНК-метилтрансферазы и большая длина гена предполагаемого контрольного белка. Отсутствие гомологии между нуклеотидными последовательностями, прилегающими к оперонам двух систем, свидетельствует о горизонтальном переносе оперонов между двумя близкими родами бактерий.
-
Термостабильная ДНК полимераза из Thermus thermophilus B35: Влияние ионов двухвалентных металлов на взаимодействие с дезоксинуклеозидтрифосфатами. // Биохимия, т.65, №5 (2000).
-
Psi I, новая эндонуклеаза рестрикции узнающая последовательность ДНК 5′-TTA^TAA-3′. // Биохимия, т 64, № 4, 481 — 482 (1999).
-
Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus Thermophilus B35: клонирование, определение первичной структуры и экспрессия гена. // Биохимия, т.64, вып.11, 1536-1543 (1999).
-
Actinobacillus and Streptococcus: producers of isoschizomers of the restriction endonucleases R.Hph I, R.Sau I, R.Nhe I, R.Mbo I and R.Swa I. // Biol. Chem., Vol. 379, 573-574, (1998). (На английском)
-
Эндонуклеаза рестрикции Sse9I из штамма Sporosarcina sp. 9D, узнающая последовательность ДНК 5′-AATT-3′. // Прикладная биохимия и микробиология, т.34, №2, 139-141 (1998).
-
Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus Thermophilus B35: выделение и характеризация некоторых свойств. // Биохимия, т.63, вып.11, 1490-1495 (1998).
-
Cloning and characterization of the gene encoding M.Fau I DNA methyltransferase. // Biol. Chem., Vol. 379, 567-568 (1998). (На английском)
-
Аффинная модификация ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus и ДНК-матрицы с помощью фотореакционноспособных производных dCTP. // Биохимия, т. 63, вып. 8, 1090-1096 (1998).
-
BstAP I, an ApaB I isoschizomer, cleaves DNA at 5′-GCANNNN^NTGC-3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 25, No 12., 2301-2302(1997).
-
AccBS I: новая эндонуклеаза рестрикции из Acinetobacter calcoaceticus BS. // Прикладная биохимия и микробиология, т. 33, № 5, 496-498 (1997).
-
Primary structure and strand specificity of BstF5 I — 1 DNA methyltransferase which recognizes 5′-GGATG-3′ // Gene, 187, 217-219 (1997). (На английском)
-
Cloning and characterization of Sse9I DNA Methyltransferase recognizing 5′-AATT-3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 24, No 14., 2790-2792 (1996). (На английском)
-
Штамм бактерий Bacillus badius — продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-(A/T)CCGG(A/T)-3′ // Патент Российской Федерации RU2053299 (1996).
-
Сайт-специфическая никаза N.BstSE из Bacillus stearothermophilus SE-589. // Молекулярная биология, т.30, №.6, 754-758 (1996).
Аннотация
Из штамма Bacillus stearothermophilus SE-589 выделена сайт-специфическая никаза, узнающая и гидролизующая последовательность ДНК в указанном стрелкой положении:
5'-G-A-G-T-C-N-N-N-N↑N-N-3'
3'-C-T-C-A-G-N-N-N-N-N-N-5'
Изучение свойств этого фермента, названного N.BstSE, свидетельствует о его вероятном родстве с эндонуклеазами рестрикции типа II. -
BstF5 I, an unusual isoschizomer of Fok I. // Gene, 172, 4951 (1996). (На английском)
-
Штамм бактерий Acinetobacter calcoaceticus 65 — продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность 5′-GGTACC-3′. // Патент Российской Федерации RU2034922 (1995).
-
CciNI, an isoschisomer of NotI from Curtobacterium citreum recognizes 5′-GC^GGCCGC-3′. // Gene, No. 157, 99-100 (1995). (На английском)
-
Sim I, a new restriction endonuclease that recognizes non-palindromic sequence 5′-GGGTC-3′ (-3/0). // Nucleic Acids Research, Vol. 23, No 14., 2571-2572 (1995). (На английском)
-
Biochemical characterization of Vsp I methyltransferase. // Gene, 157, 65-66 (1995). (На английском)
-
Bsp24I, a new unusual restriction endonuclease. // Gene, No.131, 93-95 (1993). (На английском)
-
Interaction of Vsp I and Tru9 I restriction endonuclease with synthetic oligonucleotides. // Biochimica et Biophysica Acta, 1172, 89-94 (1993). (На английском)
-
Vsp I methylase belongs to m6A-gamma class of adenine methylases. // Nucleic Acids Research, Vol. 21, No 8., 2015 (1993). (На английском)
-
Штамм бактерий Bacillus sphaericus - продуцент рестриктазы BsiI. // Авторское свидетельство SU 1784642 (1992).
-
Acs I, a new restriction endonuclease from Arthrobacter citreus 310 recognizing 5′-Pu^AATTPy-3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 20, No.14 (1992). (На английском)
-
Acl I, a new restriction endonuclease from Acinetobacter calcoaceticus recognizing 5′-AA^CGTT -3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 14, 37-87 (1992). (На английском)
-
Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia. // Прикладная биохимия и микробиология т. 28, №. 2, 309- 313 (1992).
Аннотация
Предложен метод тестирования различных штаммов актиномицетов Streptomyces и Nocardia на наличие эндонуклеаз рестрикции. Тестирование проводилось непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывали лизоцимом и тритоном Х-100, после чего клеточный лизат анализировали на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет тестировать ферменты NcoI, NotI, NruI, SfiI, Sfr303I в лизатах соответствующих штаммов-продуцентов.
-
Сравнение экспресс-методов анализа микроорганизмов на наличие активности сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции. // Прикладная биохимия и микробиология. т.28, вып.1, 152-155 (1992).
-
Штамм бактерий Proteus vulgaris - продуцент рестриктазы PvuII. // Авторское свидетельство SU 1632974 (1991).
-
Штамм бактерий Streptococcus faecalis - продуцент рестриктазы SfaNI. // Авторское свидетельство SU 1645293 (1991).
-
Штамм Streptomyces fradiae продуцент рестриктазы Sfr I. // Авторское свидетельство SU 1645300 (1991).
-
Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент рестриктазы Bli13I. // Авторское свидетельство SU 1650697 (1991).
-
Штамм бактерий Flavobacterium acuatile - продуцент рестриктазы Fan I. // Авторское свидетельство SU1661213 (1991).
-
Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Tru9I. // Сибирский биологический журнал, Вып.1, 57-59 (1991).
-
Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Acc65I. // Сибирский биологический журнал, Вып.1, 59-60 (1991).
-
Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Vha464I. // Сибирский биологический журнал, Вып.1, 60-61 (1991).
-
Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Mly113I . // Сибирский биологический журнал, Вып.2, 66-67 (1991).
-
Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Msp17I . // Сибирский биологический журнал, Вып.6, 19-20 (1991).
-
Bsp1720 I, an isoschizomer of Esp I from Bacillus species 1720 recognizing 5′-GC^TNAGC-3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 9, 2504 (1991). (На английском)
-
Выделение и изучение свойств эндонуклеазы рестрикции RsaI из Rhodopseudomonas sphaeroides. // Прикладная биохимия и микробиология, т.27, вып.3, 330-337 (1991).
-
Способ получения биомассы Streptomyces, обогащенной эндонуклеазой рестрикции SfiI. // Авторское свидетельство SU 1701745 (1991).
-
Влияние некоторых параметров культивирования на выход эндонуклеазы рестрикции SfaNI. // Прикладная биохимия и микробиология. т.27, вып.4, 486-490 (1991).
-
II-Q restriction endonucleases - new class of type II enzymes. // Nucleic Acids Research, Vol.18, No. 19, 5807-5810 (1990).
-
Штамм Streptomyces fradiae - продуцент эндонуклеазы рестрикции Sfr274I. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.1, 32-34 (1990).
-
BsiI - новая необычная эндонуклеаза рестрикции. // Молекулярная биология, т.24, Вып. 1, 244-247 (1990).
-
Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции Bse21I. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.1, 138-139 (1990).
-
Рестриктазы II типа: схема возможных эволюционных связей между ферментами с палиндромными тетрануклеотидными участками узнавания. // Молекулярная биология, т.24, Вып. 5, 1393-1398 (1990).
-
Способ очистки эндонуклеазы рестрикции Vsp I // Авторское свидетельство SU1641024 (1990).
-
Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди водных микроорганизмов озера Байкал. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.1, 35-37 (1990).
Аннотация
Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) находят широкое применение в генно-инженерных работах, что обусловливает актуальность выявления новых штаммов-продуцентов этих ферментов, являющихся более технологичными, чем известные. Поиск новых штаммов-продуцентов рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них недавно были выявлены ферменты с новой специфичностью. Целью данной работы явились обнаружение и идентификация новых штаммов-продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов уникальной экологической ниши — оз. Байкал. Изолированность экосистемы Байкала, установленная в настоящее время, обеспечивает благоприятные условия для образования новых видов организмов. Поскольку хорошо известно, что при прочих равных условиях скорость эволюции вида обратно пропорциональна продолжительности генерации, то очевидна целесообразность поиска эндемичных видов и, следовательно, продуцентов новых ферментов среди байкальских микроорганизмов, т. е. штаммов, выделенных из пелагиальной части водной толщи и донных отложений.
-
Штамм бактерий Staphilococcus saprophyticus продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции SsrI. // Авторское свидетельство SU 1486512 (1989).
-
Штамм бактерий Moraxella species - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы MspAI. // Авторское свидетельство SU 1514774 (1989).
-
Штамм бактерий Bacillus species 21 - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bse21I. // Авторское свидетельство SU 1518372 (1989).
-
Культивирование Bacillus species 21 - продуцента эндонуклеазы рестрикции Bse21I. // Извести СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.1, 108-111 (1989).
-
Штамм бактерий Paracoccus denitrieicans - продуцент эндонуклеазы рестрикции Pde12I. // Авторское свидетельство SU 1532583 (1989).
-
Штамм бактерий Brevibacterium immotum - продуцент эндонуклеазы рестрикции BimI. // Авторское свидетельство SU 1532584 (1989).
-
Способ получения биомассы Vibrio species, обогащенной эндонуклеазой рестрикции Vsp I. // Авторское свидетельство SU1559704 (1989).
-
Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Bsu15I. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.2, 108-109 (1989).
-
Выявление и определение субстратной специфичности эндонуклеаз рестрикции Bme18I и Kzo9I. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып.3, 25-26 (1989).
-
Изучение субстратной специфичности ДНК-метилазы из Flavobacterium okeanokoites. // Биоорганическая химия, Т.15, № 3, 417-418 (1989).
-
Аэробные спорообразующие бактерии как продуценты эндонуклеаз рестрикции. // Биологический журнал Армении, т.42, № 11, 969-972 (1989).
-
Определение субстратной специфичности рестриктазы Bpu10I с необычным участком узнавания. // Молекулярная биология, Т.23, Вып.4, 1051-1056 (1989).
-
Ssr I - эндонуклеаза рестрикции второго класса из Staphylococcus saphrophyticus. // Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология, № 11, 24-25 (1989).
-
Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции FauI. // Биоорганическая химия, Т.15, № 1, 130-132 (1989).
-
Иммобилизованные олигонуклеотиды как афинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции. // Биоорганическая химия, Т.15, № 3, 358-362 (1989).
-
Способ получения эндонуклеазы рестрикции Fok I из Flavobacterium okeanokoites // Авторское свидетельство SU1436160 (1988).
-
Штамм бактерий Kurthia zopfii продуцент рестрикционной эндонуклеазы Kzo9I // Авторское свидетельство SU 1440919 (1988).
-
Способ получения рестриктазы SfaNI, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-GCATC(N)5^/ 3′-CGTAG(N)9^. // Авторское свидетельство SU 1442546 (1988).
-
Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции SfeI. // Биоорганическая химия, Т.14, № 6, 848-849 (1988).
-
Новая эндонуклеаза рестрикции из почвенного штамма Bacillus megaterium 12 // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, № 14, вып. 2, 105-107 (1988).
-
Штамм бактерий Providencia stuartii - продуцент рестриктазы PstI. // Авторское свидетельство SU 1472493 (1989).
-
Поиск штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, вып. 2, 109-113 (1988).
Аннотация
Изучена зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI, узнающей и гидролизующей метилированную последовательность ДНК 5’-GCGC-3’/3’-CGCG-5’, от количества и положения метилированных по 5-ому положению цитозиновых остатков в последовательности узнавания. Существенный гидролиз ДНК происходит только в том случае, если в сайте узнавания модифицировано от двух до четырех оснований, причем в первом случае оба метилцитозина должны быть внутренними. Эффективность расщепления субстрата возрастает с увеличением количества метилированных оснований и максимальна, когда в сайте узнавания модифицированы все четыре цитозина. GlaI расщепляет сайты, содержащие 5-метилцитозины, но не N4-метилцитозины.
-
Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий. // Прикладная биохимия и микробиология, т. 24, вып. 1, 121-124 (1988).
Аннотация
Предложен метод тестирования бактериальных штаммов на наличие эндонуклеаз рестрикции. Анализ проводится непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывают лизоцимом и тритоном Х-100 и после центрифугирования супернатант анализируют на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет за 3—4 ч провести анализ до 100 колоний.
-
Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции. // Биотехнология, т.4, №5, 618-620 (1988).
Аннотация
Успехи молекулярной биологии и генетической инженерии во многом определяются наличием широкого ассортимента эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), список которых ежегодно пополняется новыми наименованиями. Обнаруживаемые ферменты необходимо охарактеризовать как по узнаваемой ими последовательности, так и по месту расщепления цепи ДНК. Идентификация сайта узнавания в настоящее время не представляет проблемы. С этой целью обычно используют совместный гидролиз ДНК изучаемыми ферментами и ферментами известной специфичности либо сравнивают экспериментальные данные с предполагаемыми картинами расщепления маркерной ДНК по сайтам узнавания.
-
Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции. // Известия СО АН СССР, Серия биологических наук, № 14, вып. 2, 102-105 (1988).
Аннотация
В начале 70-х годов были открыты первые эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), а сегодня уже налажен выпуск широкого ассортимента этих ферментов для использования в генно-инженерных работах. Одной из важнейших характеристик производимых препаратов ферментов является их чистота от примесных активностей, в частности от примесей нуклеаз и фосфатаз.
-
Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции VspI. // Биоорганическая химия, Т.13, № 3, 420-421 (1987).
-
Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции VneI. // Биоорганическая химия, Т.13, № 3, 422-423 (1987).
-
Штамм Vibrio nereis — продуцент рестриктазы VneI, узнающей и расщепляющей последовательность 5′-GTGCAC-3′. // Авторское свидетельство SU 1413954 (1986).
-
Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II. // Биохимия, т. 51, вып. 9, 1496 - 1498 (1986).
Аннотация
Изучен гидролиз ДНК фага λ рестриктазами типа II в присутствии модельных мембран из яичного фосфатидилхолина. Показано, что степень гидролиза ДНК ферментами Bsp I, Pst I и Bam HI в этих условиях резко снижена. Это не связано с необратимой инактивацией ферментов или их взаимодействием с мембраной. Наиболее вероятное объяснение ингибирования гидролиза ДНК в присутствии фосфолипидных везикул - изменение субстратных свойств ДНК в результате ее адсорбции на поверхности фосфолипидной мембраны при участии ионов Mg²⁺.
-
Фрагмент нуклеиновой кислоты для тестирования крупнощепящих рестриктаз SfiI и NotI и рекомбинантная плазмидная ДНК pDKR 85 для тестирования крупнощепящих рестриктаз SfiI и NotI. // Авторское свидетельство SU 1433020 (1986).
-
Способ получения эндонуклеазы рестрикции Rsa I из Rhodopseudomonas sphaeroides // Авторское свидетельство SU1431328 (1986).
-
Способ получения рестриктазы Hga I // Авторское свидетельство SU1389292 (1985).
Ничего не найдено.