Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI .
// BMC Molecular Biology 2008, 9:7. (На английском)
Glu I
| Название фермента | Glu I | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Прототип | GluI | ||||||||||||
| Артикул | SE-E519 | ||||||||||||
| Вариант Turbo | Отсутствует | ||||||||||||
| Высококонцентрированная версия | Отсутствует | ||||||||||||
| Тип рестриктазы | Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания. | ||||||||||||
| Сайт узнавания | 5'… G(5mC)▼NG(5mC) …3' 3'… (5mC)GN▲(5mC)G …5' | ||||||||||||
| Источник | Glacial ice bacterium GL24 | ||||||||||||
| Оптимальный буфер | SE-буфер Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) | ||||||||||||
| Оптимальная температура | 37 °C | ||||||||||||
| Температура инактивации | 80 °C | ||||||||||||
| Активность в буферах |
| ||||||||||||
| Определение единицы активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 4-6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCNGC-3`/3`-CGNCG-5`, имеющим три 5-метилцитозина. Определение активности GluI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Glu I 3: 0.5 мкл Glu I 4: 1 мкл Glu I 5: 2 мкл Glu I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. | ||||||||||||
Определение активности GluI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Glu I 3: 0.5 мкл Glu I 4: 1 мкл Glu I 5: 2 мкл Glu I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.  | |||||||||||||
| Субстрат для определения активности | Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и один канонический сайт 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` [2]. | ||||||||||||
| Условия хранения | 10 mM KH 2 PO 4 (pH 7.45); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. | ||||||||||||
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Glu I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||||
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только C5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК [1]. | ||||||||||||
| С ферментом поставляется | 10 Х SE-буфер Y. | ||||||||||||
| Литература | |||||||||||||