Kro I

Название фермента Kro I
Прототип KroI
Артикул SE-E541
Вариант Turbo Отсутствует
Высококонцентрированная версия Отсутствует
Тип рестриктазы Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания.
Сайт узнавания
5'… G▼C(5mC)GGC …3'
3'… CGG(5mC)C▲G …5'
Источник Kocurea rosea 307
Оптимальный буфер SE-буфер G (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура 37 °C
Температура инактивации 65 °C
Активность в буферах
BGOWYROSE
50100255075100
Определение единицы активности За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое дляполного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pMHpaII1/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Определение активности KroI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpaII1/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2 - исходная ДНК, pMHpaII1/DriI 3 - 0.5 мкл Kro I 4 - 1 мкл Kro I 5 - 2 мкл Kro IПродукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Определение активности KroI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpaII1/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 6 – 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2 – исходная ДНК pMHpaII1/DriI
3 – 0.5 мкл Kro I
4 – 1 мкл Kro I
5 – 2 мкл Kro I

Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Kro I
Субстрат для определения активности Субстрат pMHpaII1/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHpaII1, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHpaII1 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HpaII, которая модифицирует сайт узнавания 5`-CCGG-3` с образованием 5`-C(5mC)GG-3`/3`-GG(5mC)C-5`, и три сайта узнавания KroI 5`-GC(5mC)GGC-3`/3`-CGG(5mC)CG-5`.
Условия хранения 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 200 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Лигирование
Неспецифический гидролиз Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Kro I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК [1] и ДНК, метилированную MspI ДНК-метилтрансферазой.
С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G.
Примечания
Литература
  1. В.А. Чернухин, Е.В. Килева, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, Д.А. Гончар, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярев Новая метил-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5`-G^C(5mC)GGC-3`. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 1 ,с. 14-20 (2011).
  2. В.А. Чернухин, Р.О. Журавлева, Г.В. Тарасова, А.А. Болтенгаген, А.Г. Акишев, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев Штамм бактерии Kocuria rosea - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы KroI. // Патент на изобретение RU 2394099 С1 (2009).
  3. В.С. Дедков, Н.И. Речкунова, С.Х. Дегтярев, П.А. Жилкин, А.А. Колыхалов, В.А. Верхозина Штамм бактерий Bacillus sphaericus - продуцент рестриктазы BsiI. // Авторское свидетельство SU 1784642 (1992).
// Код для некролога