MteI-ПЦР-анализ-новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека.
// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 3 ,с. 15-23 (2013).
Mte I
| Название фермента | Mte I | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Прототип | Mte | ||||||||||||
| Артикул | SE-E553 | ||||||||||||
| Вариант Turbo | Отсутствует | ||||||||||||
| Высококонцентрированная версия | Отсутствует | ||||||||||||
| Тип рестриктазы | Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания. | ||||||||||||
| Сайт узнавания | 5'… G(5mC)G(5mC)▼NG(5mC)G(5mC) …3' 3'… (5mC)G(5mC)GN▲(5mC)G(5mC)G …5' |
||||||||||||
| Источник | Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Mte I из Microbacterium testaceum 17B | ||||||||||||
| Оптимальный буфер | SE-буфер W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) | ||||||||||||
| Оптимальная температура | 55 °C | ||||||||||||
| Температура инактивации | не инактивируется | ||||||||||||
| Активность в буферах |
|
||||||||||||
| Определение единицы активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10/DriI дополнительно метилированной M.Fsp4HI за 1 час при 55°С в 50 мкл реакционной смеси Определение активности MteI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 2 - Контрольная ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI, 3 - 0.5 мкл MteI (разб. 1/40), 4 - 1 мкл MteI (разб. 1/40), 5 - 2 мкл MteI (разб. 1/40), 6 - 1 мкл неразбавленного фермента MteI, 1 и 7- 1 Kb SE ДНК-маркеры.Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE | ||||||||||||
Определение активности MteI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 2 - Контрольная ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI, 3 - 0.5 мкл MteI (разб. 1/40), 4 - 1 мкл MteI (разб. 1/40), 5 - 2 мкл MteI (разб. 1/40), 6 - 1 мкл неразбавленного фермента MteI, 1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.  | |||||||||||||
| Субстрат для определения активности | Субстрат pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI10, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI и метилированной ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI. Плазмида pHspAI10 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HspAI, которая модифицирует сайт узнавания 5`-GCGC-3` с образованием 5`-G(5mC)GC-3`/3`-CG(5mC)G-5`. Кроме того, данная плазмида дополнительно метилирована ДНК-метилтрасферазой М.Fsp4HI, которая модифицирует сайт 5`-GCNGC-3` с образованием 5`-G(5mC)NGC-3`/3`-CGN(5mC)G-5`. В результате в используемом субстрате имеется один канонический сайт узнавания МteI 5`-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5`. МteI может также расщеплять сайт узнавания, включающий шесть 5-метилцитозинов [1], однако активность фермента в этом случае меньше более чем на порядок. | ||||||||||||
| Условия хранения | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. | ||||||||||||
| Лигирование | |||||||||||||
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 40 ед фермента Mte I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 55°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||||
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. | ||||||||||||
| С ферментом поставляется | 10 Х SE-буфер W, pHspAI10/DriI дополнительно метилированная M.Fsp4HI. | ||||||||||||
| Примечания | |||||||||||||
| Литература | |||||||||||||