Штамм бактерии Arthrobacter oxydans - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы AoxI. // Патент на изобретение RU 2399663 С1 (2009).
Aox I
| Название фермента | Aox I | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Прототип | AoxI | ||||||||||||
| Артикул | SE-E569 | ||||||||||||
| Вариант Turbo | Отсутствует | ||||||||||||
| Высококонцентрированная версия | Отсутствует | ||||||||||||
| Тип рестриктазы | Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания. | ||||||||||||
| Сайт узнавания | 5'… ▼RG(5mC)Y …3' 3'… Y(5mC)GR▲ …5' |
||||||||||||
| Источник | Arthrobacter oxydans 25K | ||||||||||||
| Оптимальный буфер | SE-буфер AoxI (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 3 mM MgCl2; 1 mM DTT.) | ||||||||||||
| Оптимальная температура | 60 °C | ||||||||||||
| Температура инактивации | не инактивируется | ||||||||||||
| Активность в буферах |
|
||||||||||||
| Определение единицы активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза линейной формы 1 мкг плазмиды pMHaeIII/DriI за 1 час при 60°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHaeIII/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Определение активности AoxI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHaeIII/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1: исходная ДНК pMHaeIII/DriI 2: 0.5 мкл Aox I 3: 1 мкл Aox I 4: 2 мкл Aox I 5: 1 Kb SE ДНК-маркеры Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE. | ||||||||||||
Определение активности AoxI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHaeIII/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1: исходная ДНК pMHaeIII/DriI 2: 0.5 мкл Aox I 3: 1 мкл Aox I 4: 2 мкл Aox I 5: 1 Kb SE ДНК-маркеры Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.  | |||||||||||||
| Субстрат для определения активности | Субстрат pMHaeIII/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHaeIII, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHaeIII содержит ген ДНК-метилтрансферазы M.HaeIII из Haemophilus aegyptuus, которая модифицирует сайт узнавания 5` GGCC 3` с образованием 5` GG(5mC)C 3`/3` C(5mC)GG 5`. | ||||||||||||
| Условия хранения | 10 mM Tris-HCl (pH 7.4); 100 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. | ||||||||||||
| Лигирование | |||||||||||||
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Aox I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 60°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||||
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. | ||||||||||||
| С ферментом поставляется | 10 Х SE-буфер AoxI. | ||||||||||||
| Примечания | |||||||||||||
| Литература | |||||||||||||