Метилирование ДНК

Общие рекомендации:

ДНК-метилтрансферазы требуют присутствия SAM (S-аденозил-L-метионин) в качестве донора метильной группы. Следует помнить, что SAM стабилен только в кислой среде и должен храниться отдельно при
-20oC. Он добавляется в реакционную смесь непосредственно перед постановкой реакции. Если объем реакционной смеси минимальный, например 10-20 мкл, то стоковый раствор SAM можно предварительно разбавить 5 мМ раствором H2SO4 или водой, хранить при -20°. Значительная часть ДНК-метилтрансфераз не требует ионов Mg2+ для проявления активности.

Метилирование ДНК метилтрансферазой (стандартный протокол)

На 50 мкл реакционной смеси:

• Реакционный буфер* (десятикратный) – 5 мкл;
• Препарат ДНК – от 0.3 до 1.5 мкг;
• SAM – до 80 мкМ (в некоторых случаях до 160 мкМ)
• Вода – до конечного объема 50 мкл.
• + 1-10 единиц ДНК-метилтрансферазы.

* – в случае, когда после реакции метилирования требуется осуществить реакцию гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции, и нет существенных различий в составе буферов для метилазы и рестриктазы, реакцию метилирования можно проводить в рестрикционном буфере (+SAM).

Инкубировать в течение 0.5-1 часа при оптимальной для фермента температуре.
При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 15 мин при 65o C или 80o C.

Добавить 1-2 мкл эндонуклеазы рестрикции (если реакция осуществлялась в рестрикционном буфере). Далее провести реакцию гидролиза.

В остальных случаях следует переосадить ДНК этанолом, а затем растворить в однократном буфере для рестрикции. После чего провести реакцию гидролиза. Если расщеплять метилированную ДНК не требуется, то можно растворить осадок в воде или буфере ТЕ.

Проанализировать результат реакции путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.