Рестрикция геномной ДНК

Общие рекомендации:

Многие эндонуклеазы рестрикции чувствительны к примесям в препаратах ДНК, и поэтому степень гидролиза данной ДНК ферментами зависит от метода ее очистки. Следует также помнить, что следы фенола, которые могут остаться в случае использования фенольного способа очистки геномной ДНК, ингибируют активность рестриктаз.
На степень гидролиза геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции может влиять специфическое метилирование ДНК, которое характерно и для бактериальных, и для эукариотических клеток. Такие модификации могут препятствовать гидролизу геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции в случае перекрывания их сайтов узнавания с метилированными последовательностями.
Надо иметь в виду, что иногда эндонуклеазы рестрикции могут давать при гидролизе геномной ДНК очень крупные фрагменты, которые бывает невозможно разделить с помощью обычного электрофореза в агарозном геле (необходим пульс-электрофорез). С другой стороны, высокая частота встречаемости сайтов узнавания многих рестриктаз на высокомолекулярной ДНК приводит к образованию при гидролизе очень плотного распределения фрагментов. Поэтому картина расщепления в геле часто бывает смазанной, и напоминает картину, характерную для неспецифических нуклеаз.

Гидролиз геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции (стандартный протокол)

На 20 мкл реакционной смеси:

• Рестрикционный буфер (десятикратный) – 2 мкл;
• Геномная ДНК – от 0.5 до 1 мкг;
• Вода – до конечного объема 20 мкл.
• + 2-10 единиц эндонуклеазы рестрикции.

Инкубировать в течение 0.5-1 часа при оптимальной для фермента температуре.
Нанести 10-15 мкл реакционной смеси на 0.7-1% агарозный гель для проведения электрофореза.
При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 20 мин при 65 или 80 o C , либо путем обработки фенолом-хлороформом и переосаждением ДНК этанолом.