Рестрикция ПЦР фрагментов ДНК

Общие рекомендации:

Для получения исчерпывающего гидролиза ПЦР фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции рекомендуется использовать неразбавленные ферменты.
Многие эндонуклеазы рестрикции чувствительны к примесям компонентов реакционной смеси ПЦР. Поэтому для получения лучшего результата рекомендуется проводить очистку ПЦР фрагментов, например, с помощью спин-колонок, элюции ДНК из геля и т.д. В случае использования в реакции ПЦР минерального масла рекомендуется провести очистку ДНК-продукта фенолом/хлороформом с последующим переосаждением этанолом.

Гидролиз ПЦР фрагмента ДНК (стандартный протокол)

• На 20 мкл реакционной смеси:
• Рестрикционный буфер (Х 10) – 2 мкл;
• ПЦР фрагмент ДНК – от 0.1 до 0.5 мкг (или 5-10 мкл реакц. смеси ПЦР);
• Очищенная вода – до конечного объема 20 мкл
• + 0.5-1 (но не более 2) мкл эндонуклеазы рестрикции.

Инкубировать в течение 1 часа при оптимальной для фермента температуре. В случае необходимости время инкубации может быть увеличено до 4-16 часов.

Нанести 10-15 мкл реакционной смеси на 0.8-1.5% агарозный или 4-10% полиакриламидный (в зависимости от ожидаемой длины рестриктов) гель для проведения контрольного электрофореза.

При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 20 мин при 65 или 80o C , либо путем обработки фенолом/хлороформом и переосаждением ДНК этанолом.