Рестрикция плазмидной ДНК

Общие рекомендации:

Для получения исчерпывающего гидролиза плазмидной ДНК (особенно её суперскрученной формы) эндонуклеазами рестрикции в подавляющем большинстве случаев требуется в 2-10 раз больше единиц фермента по сравнению с гидролизом ДНК фага лямбда или ДНК фага Т7. Особенно это касается ферментов, имеющих на плазмиде единственный сайт узнавания.
Многие эндонуклеазы рестрикции чувствительны к примесям в препарате плазмидной ДНК, например, к присутствию остатков сорбента, используемого при выделении плазмиды. Следует также помнить, что следы фенола, которые могут остаться в случае использования фенольного способа очистки плазмидной ДНК, ингибируют активность рестриктаз.
При выборе эндонуклеаз рестрикции, которыми требуется гидролизовать плазмидную ДНК, следует учесть, что некоторые штаммы E . coli , в которых нарабатывается плазмида, могут содержать системы метилирования ДНК. Например, Dam -метилаза вносит метильную группу в позицию N 6 остатка аденина в последовательности GATC , а Dcm -метилаза модифицирует остаток цитозина в положении C 5 в последовательности CCA / TGG . Соответственно эти модификации могут препятствовать гидролизу плазмидной ДНК некоторыми эндонуклеазами рестрикции в случае перекрывания их сайтов узнавания с данными последова-тельностями.

Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции (стандартный протокол)

На 20 мкл реакционной смеси:

• Рестрикционный буфер (десятикратный) – 2 мкл;
• Плазмидная ДНК – от 0.3 до 1 мкг;
• Вода – до конечного объема 20 мкл.
• + 2-10 единиц эндонуклеазы рестрикции.

Инкубировать в течение 1 часа при оптимальной для фермента температуре.
Нанести 10-15 мкл реакционной смеси на 1-1.5% агарозный или 4-10% полиакриламидный (в зависимости от ожидаемой длины рестриктов) гель для проведения электрофореза.
При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 20 мин при 65 или 80o C , либо путем обработки фенолом-хлороформом и переосаждением ДНК этанолом.

Следует учитывать, что препараты эндонуклеаз рестрикции поставляются в буфере для хранения, содержащем 50% глицерин. А концентрация глицерина в реакционной смеси в процессе гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции не должна превышать 5% (т.е. объем добавленного препарата фермента должен быть не больше 1/10 части от объема реакционной смеси). Поэтому в случае, когда для достижения исчерпывающего гидролиза ДНК требуется большее количество фермента, следует увеличить объем реакционной смеси до 30-50 мкл, либо увеличить время инкубации до 2-4 часов.

При необходимости гидролизовать препаративное количество плазмидной ДНК (10-20 мкг) рекомендуется увеличить объем реакционной смеси вплоть до 400 мкл, а так же следует брать эндонуклеазу рестрикции в количестве не менее 5 ед активности на 1 мкг ДНК.