Gla I

Описание

Сайт узнавания:

Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Gla I из Glacial ice bacterium Gl29

Определение единицы активности:

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг плазмиды pHspAI2/GsaI по единственному сайту 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5` за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pHspAI2/GsaI и образование двух основных (3,419 и 699 п.н.) фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCGC-3`/3`-CGCG-5`, имеющим три и два 5-метилцитозина.

Определение активности GlaI

В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI2/GsaI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 2 — Контрольная ДНК pHspAI2/GsaI, 3 — 0.5 мкл GlaI (разб. 1/100), 4 — 1 мкл GlaI (разб. 1/100), 5 — 2 мкл GlaI (разб. 1/100), 6 — 1 мкл неразбавленного фермента GlaI, 1 и 7- 1 Kb SE ДНК-маркеры. Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE. Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.

Субстрат для определения активности:

Субстрат pHspAI2/GsaI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI2, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции GsaI. Плазмида pHspAI2 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species A1, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.HspAI, и единственный канонический сайт узнавания GlaI 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5`[2].

Оптимальный буфер: SE-буфер Y

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1% Triton X-100, 50 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 100 ед фермента Gla I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.

Чувствительность к метилированию:

Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет ДНК, содержащую N4-метилцитозин [1].

С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y, плазмида pHspAI2/GsaI.

Примечание: Литература:

1. Землянская Е. В., Дегтярев С. Х. Субстратная специфичность и свойства метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз.// Молекулярная биология, том 47, № 6, с. 900–913(2013)

2. Тарасова Г.В., Наякшина Т.Н., Дегтярев С.Х. Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7 — на английском языке

3. Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дегтярев С.Х. Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2006, т.2, №1, с. 30-39.

4. Чернухин В.А. , Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5’-G(5mC)^GC-3’. // Биотехнология, 2006, № 4, С.31-35

5. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Мезенцева Н.В., Томилова Ю.Э., Дегтярев С.Х., Дедков В.С. Штамм бактерий Glacial ice bacterium I — продуцент эндонуклеазы рестрикции Gla I.//Патент на изобретение RU 2287012 С1 (2006)

Применение:

Zhou S, Sun H, Huo D, Wang X, Qi N, Peng L, Yang M, Lu P, Hou C. A novel methyl-dependent DNA endonuclease GlaI coupling with double cascaded strand displacement amplification and CRISPR/Cas12a for ultra-sensitive detection of DNA methylation.// Analytica Chimica Acta, Volume 1212, 15 June 2022

Hao Yang, Jiani Qiu, LinQing Zhen, Yizhou Huang, Wei Ren, Hongchen Gu, Hong Xu, Gaolian Xu. Sensitive GlaI digestion and terminal transferase PCR for DNA methylation detection// Talanta 2022 Sep 1;247:123616 (2022)

 Dong N, Wang W, Qin Y, Wang Y, Shan H. Sensitive lateral flow assay for bisulfite-free DNA methylation detection based on the restriction endonuclease GlaI and rolling circle amplification// Analytica Chimica Acta, Volume 1227, 22 September 2022

Wang LJ, Han X, Qiu JG, Jiang B, Zhang CY. Cytosine-5 methylation-directed construction of a Au nanoparticle-based nanosensor for simultaneous detection of multiple DNA methyltransferases at the single-molecule level// Chem Sci. 2020, 11, 9675-9684 (2020)

 Petrova, D. V., Naumenko, M. B., Khantakova, D. V., Grin, I. R. & Zharkov, D. O. Relative Efficiency of Recognition of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine by Methyl-Dependent DNA Endonuclease GlaI// Russian Journal of Bioorganic Chemistry T. 45, № 6, стр. 625-629. (2019)

Susan M Mitchell, Keith N Rand, Zheng-Zhou Xu, Thu Ho, Glenn S Brown, Jason P Ross, Peter L Molloy Helper-Dependent Chain Reaction (HDCR) for Selective Amplification of Methylated DNA Sequences // Methods Mol Biol (2018)

Yueying Sun, Yuanyuan Sun, Weimin Tian, Chenghui Liu, * Kejian Gao and Zhengping L A novel restriction endonuclease GlaI for rapid and highly sensitive detection of DNA methylation coupled with isothermal exponential amplification reaction// Chemical Science, 9, pp.1344-1351 (2017)

Viktor Tomilov, Murat Abdurashitov, Danila Gonchar, Anastasiya Snezhkina, George Krasnov, Anna Kudryavtseva and Sergey Degtyarev Comparative analysis of RCGY sites methylation in the genomes of Raji and U-937 malignant and normal lung fibroblast cell lines// Cancer Epigenetics and Biomarkers, Osaka, Japan, Октябрь 2017

A.G. Akishev et al. GLAD-PCR assay of selected R(5mC)GY sites in URB1 and CEPBD genes in human genome.// Res J Pharm Biol Chem Sci, 8(1): pp.465-475, (2017)

Evdokimov et al. GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer.// Biol Med (Aligarh) , 8:7(2016)

А.А.Евдокимов, Н.А.Нетесова, Н.А.Сметанникова, М.А.Абдурашитов, А.Г.Акишев, Е.С.Давидович, В.В. Кузнецов, Ю.Д.Ермолаев, А.Б.Карпов, А.Э.Сазонов, Р.М.Тахауов, С.Х.Дегтярев Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке.// Вопросы онкологии, №1, стр. 116-120 (2016)

EV Dubinin, AG Akishev, MA Abdurashitov, SB Oleynikova, VL Sitko, and S Kh Degtyarev Real time GlaI-PCR assay of regulation regions of human genes HDAC4, RARB and URB1.// Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, vol 7(2), p.p. 667-676 (2016).

Murat A . Abdurashitov , Valery A . Chernukhin , Danila A . Gonchar , Vladimir S . Dedkov, Natalia A . Mikhnenkova, and Sergey Kh . Degtyarev Dimethyl Sulfoxide Changes the Recognition Site Preference of Methyl- directed Site-specific DNA Endonuclease GlaI.// Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, № 7(1),с. 1733-1739 (2016)

Abdurashitov M.A., Tomilov V.N., Gonchar D.A., Kuznetsov V.V., Degtyarev S.Kh. Mapping of R(5mC)GY Sites in the Genome of Human Malignant Cell Line Raji.// Biol Med (Aligarh) Volume 7, Issue 4, BM-135-15 (2015)

Кузнецов В.В., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК.// Патент на изобретение RU 2525710 С1 (2014)

Fagan RL, Wu M, Chedin F, Brenner C An Ultrasensitive High Throughput Screen for DNA Methyltransferase 1-Targeted Molecular Probes //PLoS ONE 8(11): e78752. doi:10.1371/journal.pone.0078752(2013) — на английском языке

Keith N. Rand, Graeme P. Young, Thu Ho and Peter L. Molloy, «Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylationdependent restriction enzymes.»//, Nucleic Acids Research, pp. 1-10 (2012).

F. Syeda, R.L. Fagan, M. Wean, G.V. Awakumov, J.R. Walker, S. Xue, S. Dhe-Paganon, & C. Brenner, «The RFTS Domain is a DNA-competitive Inhibitor of Dnmt1»//, JBC, v. 286, pp. 15344-15351 (2011).

А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 — 16

Kravets AP, Mousseau TA, Litvinchuk AV, Ostermiller Sh, Vengen GS, Grodzinski DM. Changes in wheat DNA methylation pattern after chronic seed gamma-irradiation.// Tsitol Genet. 2010 Sep-Oct;44(5):18-22. Russian.

Wood, R. J., McKelvie, J. C., Maynard-Smith, M. D., and Roach, P. L. A real-time assay for CpG-specific cytosine-C5 methyltransferase activity.// (2010) Nucleic Acids Res 38, e107

Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2010. – Т. 6 – № 1 – С. 5-12

Абдурашитов М.А., Чернухин В.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. GlaI digestion of mouse γ-satellite DNA: study of primary structure and ACGT sites methylation // BMC Genomics 2009, 10:322. — на английском языке

В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.