Термолабильная щелочная фосфатаза

850,00 руб.3400,00 руб.

  • Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2
  • Оптимальный буфер: SE-буфер W
  • Оптимальная температура: 16
Артикул: E365 Категория:

Описание

Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2

Описание:
Термолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.

Определение единицы активности:
За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат.

Оптимальный буфер: SE-буфер W
Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25&#176:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин.
Хранить при -20°С.

Примечание:
Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III.

Протокол дефосфорилирования 5′-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) — 2 мкл,
ДНК — 0,5-1мкг,
деионизованная вода — до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием.
Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре.
Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!!
Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%).
Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин.
Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов.Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.
Литература:

Доступные варианты

АртикулРазмер фасовкиФасовкаКонцентрацияЦена 
E365S200 е.а.5000 е.а./мл850,00 руб.
E366L1000 е.а.5000 е.а./мл3400,00 руб.