Применение Протеиназы К

Протеиназа К – это неспецифичная сериновая протеаза с очень высокой протеолитической активностью. Активна в растворах с большим диапазоном значений pH (4.0-12.5), рабочий диапазон температур – 37-60 °C. Способна сохранять активность в присутствии ЭДТА (0.5 M), GuHCl (3 M), мочевины (4 M). Также активна в присутствии таких детергентов, как Tween 20 (5%), Triton X-100 (1%), SDS (1%).

Применение:

Выделение плазмидной и геномной ДНК;
Выделение РНК;
Инактивация ДНКаз, РНКаз и других ферментов.

Стандартная рабочая концентрация Протеиназы К – 100 мкг/мл (допустимо 20-200 мкг/мл, в зависимости от метода). Перед применением рекомендуется приготовить стоковый раствор (20 мг/мл) в воде или буфере TE x1 (10 mM Трис-HCl, pH 8.0, 1 mM ЭДТА). Допускается хранение стокового раствора при – 20 oC.

Применение Протеиназы К на примере методики выделения ДНК из клеток млекопитающих (по Манниатису)

Залить свежевырезанную ткань жидким азотом в чашке из нержавеющей стали.
Измельчить замороженную ткань блендером.
Дать жидкому азоту испариться.
Добавить 10 объёмов буфера для экстракции:

10 mM Трис-HCl, pH 8.0; 100 mM ЭДТА; 20 мкг/мл панкреатической РНКазы;
0.5% SDS.

Мягко суспендировать взвесь. Перенести раствор в подходящий центрифужный стакан (например, на 50 мл).
Добавить Протеиназу К (сток – 20 мг/мл) до концентрации 100 мкг/мл. Стеклянной палочкой мягко перемешать вязкий раствор.
Поместить суспензию в водяную баню на 3 часа при 50 oC для лизиса. Периодически мягко перемешивать раствор.
Охладить раствор до комнатной температуры. Добавить равный объём фенола, уравновешенного 0.5 M Трис-HCl, pH 8.0, и мягко перемешать в течение 10 мин до относительной однородности (в случае необходимости перемешивать дольше).
Центрифугировать при 5000 g в течение 15-20 мин при + 10 oC.
Медленно и аккуратно отобрать вязкую верхнюю (водную) фазу в чистый центрифужный стакан и дважды повторить экстракцию ДНК фенолом.
Верхнюю фазу поместить в диализный мешок и диализовать в течение ночи против буфера TE x1 при + 4 °C.