Расщепление нативной ДНК (РНК) Эндонуклеазой I (из Proteus vulgaris 84)

Общие рекомендации:

Исследование действия Эндонуклеазы I на различные субстраты показало, что максимальную активность фермент проявляет в отношении нативной ДНК. Скорость гидролиза денатурированной ДНК составляет 84 % от скорости гидролиза нативной ДНК. Скорость гидролиза РНК еще ниже и составляет 32 % для высокополимерной дрожжевой РНК и 21 % для суммарной РНК.
Основными продуктами расщепления ДНК являются три-, тетра- и пентануклеотиды с 5′-фосфатной группой на конце, а образования мононуклеотидов практически не наблюдается.
Активность фермента достигает максимума в глицин-NaOH-буфере, pH 9,5. Фермент наиболее активен при 37°C. При 24°C и 42°C скорость ферментативного гидролиза ДНК значительно ниже и составляет соответственно 12 и 30 % от активности при 37°C. Прогревание ферментного препарата в течение 2 мин при 95°C приводит к полной инактивации Эндонуклеазы I. Зависимость активности фермента от концентрации Mg2+ представляет собой колоколообразную кривую с достаточно широким максимумом (от 15 до 35 мМ).

Стандартный протокол

• На 20 мкл реакционной смеси:
• SE буфер Эндонуклеаза I (x10) – 2 мкл;
• Нативная ДНК – от 0.3 до 1 мкг;
• Вода (Milli-Q) – до конечного объема 20 мкл

________________________________

• + 1-5 единиц Эндонуклеазы I

Инкубировать в течение 0.5-1 часа при температуре 37°C.

При необходимости, инактивировать фермент прогреванием в течение 2 мин при 95 °C.

Примечание:

В случае, когда для достижения исчерпывающего гидролиза ДНК (РНК) требуется большее количество фермента, следует увеличить объем реакционной смеси до 30-50 мкл, либо увеличить время инкубации до 2-4 часов.
При необходимости гидролизовать препаративное количество ДНК (10-20 мкг) рекомендуется увеличить объем реакционной смеси вплоть до 400 мкл, а также следует брать Эндонуклеазу I в количестве не менее 1 ед. активности на 1 мкг ДНК.