Протокол для проведения ПЦР с Hot Start Taq ДНК полимеразой

Приготовление реакционной смеси

Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят “мастер-микс”, содержащий воду, буфер, MgCl2 , дезоксинуклеозидтрифосфаты , праймеры и Hot Start Taq ДНК полимеразу в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор содержащий ДНК-матрицу. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли, пробирки ставятся в амплификатор и проводится термоциклирование.

Пример: (амплификация фрагмента ДНК фага лямбда длиной 2 тысячи пар нуклеотидов)

Количество пробирок 1 – 10

• Вода стерильная деионизованная 27.8 мкл 278 мкл
• ДНК-матрица (ДНК фага лямбда 2 мкг/мл) 5 мкл 50 мкл
• dNTP смесь ( 0.5mM каждого) 5 мкл 50 мкл
• Смесь праймеров прямого и обратного (1μM каждый) 5 мкл 50 мкл
• 10X Hot Start Taq буфер 5 мкл 50 мкл
• MgCl2 ( 50 mM ) 2 мкл 20 мкл
• Hot Start Taq ДНК-полимераза (5 ед.акт./мкл ) 0.2 мкл 2 мкл

Наслоить минеральное масло.

Поставить пробирки в амплификатор

Выдержать 3 мин при 94 °С.

Провести 30 циклов: 95 °С – 15 сек,

64 °С – 30 сек,

72 °С- 2 мин.

Завершение 72 ° С- 5 мин.

Hot Start Taq ДНК-полимераза

Обычно 1-1.5 ед.акт. Hot Start Taq ДНК полимеразы используется в 50мкл реакционной смеси. Более высокие концентрации фермента могут приводить к синтезу неспецифических продуктов.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно варьируются в зависимости от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.