Протокол для проведения ПЦР с Hot Start Taq ДНК полимеразой
Приготовление реакционной смеси
Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят “мастер-микс”, содержащий воду, буфер, MgCl2 , дезоксинуклеозидтрифосфаты , праймеры и Hot Start Taq ДНК полимеразу в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор содержащий ДНК-матрицу. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли, пробирки ставятся в амплификатор и проводится термоциклирование.
Пример: (амплификация фрагмента ДНК фага лямбда длиной 2 тысячи пар нуклеотидов)
Количество пробирок 1 – 10
- Вода стерильная деионизованная 27.8 мкл 278 мкл
- ДНК-матрица (ДНК фага лямбда 2 мкг/мл) 5 мкл 50 мкл
- dNTP смесь ( 0.5mM каждого) 5 мкл 50 мкл
- Смесь праймеров прямого и обратного (1μM каждый) 5 мкл 50 мкл
- 10X Hot Start Taq буфер 5 мкл 50 мкл
- MgCl2 ( 50 mM ) 2 мкл 20 мкл
- Hot Start Taq ДНК-полимераза (5 ед.акт./мкл ) 0.2 мкл 2 мкл
Наслоить минеральное масло.
Поставить пробирки в амплификатор
Выдержать 3 мин при 94 °С.
Провести 30 циклов: 95 °С – 15 сек,
64 °С – 30 сек,
72 °С- 2 мин.
Завершение 72 ° С- 5 мин.
Hot Start Taq ДНК-полимераза
Обычно 1-1.5 ед.акт. Hot Start Taq ДНК полимеразы используется в 50мкл реакционной смеси. Более высокие концентрации фермента могут приводить к синтезу неспецифических продуктов.
Условия термоциклирования
Параметры амплификации сильно варьируются в зависимости от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.