Протокол реакции с Т4 ДНК лигазой

Общие рекомендации

Буфер для лигирования входит в комплект с ферментом. Данный буфер не следует размораживать много раз во избежание многократного выпадения АТФ в осадок. Поэтому при первой разморозке буфера рекомендуется слегка нагреть его (до 35-37 °С) и несколько раз встряхнуть до полного растворения осадка. Затем расфасовать его небольшими объемами (20-50 мкл) в отдельные пробирки, заморозить и использовать эти аликвоты не более 2-3 раз. Допускается хранение размороженного буфера при +4 °С в течение 7 дней.

Реакцию лигирования следует проводить в минимальном объеме (10-20 мкл) с целью увеличения концентрации концов ДНК, и, соответственно эффективности сшивки. Рекомендуемая концентрация концов ДНК – от 0.1 до 1 мкМ. Следует учесть, что эффективность сшивки выступающих «липких» концов выше, чем «тупых» концов. Соответственно, более протяженные «липкие» концы сшиваются лучше коротких.

Мы рекомендуем добавлять в реакцию 1-2 мкл (1/10 объема) T4 ДНК лигазы, но не менее 100 ед. Фермент с активностью 200 ед/мкл и более можно добавлять в количестве 0.5-1 мкл или предварительно разбавить буфером для хранения и разбавления ферментов (Cat.# B100)

Стандартную реакцию лигирования можно проводить при 16 °С в течение 0.5-2 ч. Но в большинстве случаев наилучшие результаты достигаются при инкубировании реакционной смеси в течение ночи при 4-6 °С.

Соотношение сшиваемых фрагментов ДНК подбирается экспериментальным путем. Например, при необходимости сшивки векторной плазмиды и фрагмента(ов) геномной ДНК можно использовать соотношения от 1:5 до 1:0.5, соответственно.

Лигирование фрагментов ДНК с помощью Т4 ДНК лигазы (стандартный протокол)

• На 10 мкл реакционной смеси:
• Реакционный буфер (десятикратный) – 1 мкл;
• Фрагмент 1 (0.1 мг/мл) – 1 мкл;
• Фрагмент 2 (0.1 мг/мл) – 1-5 мкл;
• Вода (Milli-Q) – до конечного объема 10 мкл

_________________________________

• + 0.5-1 мкл (100 ед.) Т4 ДНК лигазы.
• Инкубировать в течение 16 ч при 4-6 °С.

При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 10 мин при 65 °C. Если требуется, переосадить ДНК этанолом.