Протокол для проведения ПЦР с Taq ДНК полимеразой

Приготовление реакционной смеси

Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят “мастер-микс”, содержащий воду, буфер с MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты и праймеры в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор содержащий ДНК-матрицу. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли и пробирки ставятся в амплификатор. После первичной денатурации устанавливается температура 80 град Цельсия при которой(не вынимая пробирки из амплификатора) добавляется Taq ДНК полимераза из расчета 1 единица на 50(+5) мкл реакционной смеси. Этот метод постановки реакций не только сберегает время за счет уменьшения числа переноса реагентов и минимизирует возможность ошибок при пипетировании , но и повышает специфичность реакции за счет уменьшения вероятности появления побочных продуктов.

Пример:

1. Смешать:

вода (до 49 мкл) 24 мкл
dNTP mix 0.5 мМ 5 мкл
P1 + P2 1 мкМ 10 мкл
ДНК Т7 2 нг / мкл 5 мкл
10 x Буфер 5 мкл

2. Наслоить поверх реакционной смеси 40 мкл минерального масла.
3. Выдержать 3 мин при 94 °С.
4. Выдержать 1 мин при 80 °С.
5. Добавить 1 мкл фермента.
6. Выдержать 2 мин при 53 °С
7. Провести 30 циклов: 72 °С – 1 мин, 94 °С – 1 мин, То – 53 °С- 2 мин.
8.. Выдержать 2 мин при 72°С.
9. Остановить реакцию (поставить в ледяную баню).
10. Полученный продукт контрольной реакции имеет длину 1 kb.
11. Аналогично провести реакцию с другими праймерами и матрицей. Время инкубации при 72 °С выбрать исходя из соотношения 1 мин на 1 kb получаемого продукта реакции.

Для праймеров длиной от 18 до 28 нуклеотидов и содержанием g/c нуклеотидов 50-60% То примерно рассчитать по формуле :
То=(4х кол-во g/c нуклеотидов)+(2х кол-во a/t нуклеотидов) – 5
При отсутствии продукта То уменьшить на 5-10°С.
При появлении побочных продуктов реакции То увеличить на 2-4 °С.
При желании использовать высокие концентрации праймеров и dNTP увеличить концентрацию MgCl2 на 2-4 мМ.
Для выполнения параллельно более 24 реакций готовят в ледяной бане (внимание!: не на льду!) “мастер-микс”, содержащий воду, буфер без MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры и Taq-полимеразу в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляются растворы содержащие ДНК-матрицу и MgCl2. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли и пробирки ставятся в амплификатор, предварительно нагретый до 95 град Цельсия.
Этот метод постановки реакции удобен, особенно для начинающих, хотя может приводить к снижению чувствительности и специфичности реакции.

Процедура приготовления реакционной смеси

1. Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать .
2. Держать пробирки с растворами в ледяной бане (внимание!: не на льду!).
3. Смешать, в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане:

Вода стерильная деионизованная
ДНК-матрица
0.5mM dNTP смесь
Праймеры прямой и обратный
10X Taq буфер
25mM MgCl2(при необходимости)
Taq ДНК-полимераза

4. Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
5. Покрыть образец минеральным маслом (три четверти объема образца) либо подходящим количеством воска. Эта процедура может быть исключена, если амплификатор снабжен нагреваемой крышкой.
6. Поместить образцы в амплификатор и начать ПЦР.

Праймеры

Среди различных рекомендаций по подбору праймеров наиболее существенными, на наш взгляд, являются следующие:

Праймеры для ПЦР обычно длиной 17-28 нуклеотидов. Более длинные праймеры обеспечивают повышенную специфичность.
Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование <праймер-димеров>.
Температура отжига обычно ниже температуры плавления примерно на 5°C.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

Производимые НПО СибЭнзим смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5mM , 2.5mM , и 4 mM , удобных для прямого использования в ПЦР.

Taq ДНК-полимераза

Обычно 1-1.5u Taq ДНК полимеразы используется в 50чl реакционной смеси. Более высокие концентрации Taq могут вызывать синтез неспецифических продуктов.

Предотвращение упаривания реакционной смеси.

При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60 °C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.

Завершающая стадия синтеза

После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72 °C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5 штрих концов ПЦР продуктов комплементарной цепью. Также на этой стадии матрично-независимая активность Taq ДНК-полимеразы добавляет к 3′-концам подуктов ПЦР дополнительный нуклеотид (чаще всего А). Поэтому, если фрагменты ПЦР предназначены для клонирования в T- вектора, эта стадия может быть продлена до 30 мин.
Если полоса продукта ПЦР в окрашенном бромистым этидием агарозном геле размазана, выполняются следующие действия, по отдельности либо в сочетании: уменьшение концентрации фермента, ионов магния; удлинение времени либо повышение температуры денатурации; уменьшение общего числа циклов; уменьшение возможности загрязнения.
Примеси в препаратах ДНК-матрицы могут изменять pH ПЦР, а также прямо ингибировать полимеразу. Повышение температуры выше 95 °C может необратимо инактивировать фермент.