Протокол для ПЦР с Vent ДНК полимеразой

Приготовление реакционной смеси

Во время приготовления реакционной смеси пробирки с растворами следует держать в ледяной бане. Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят в одной пробирке “мастер-микс”, содержащий воду, реакционный буфер для Vent ДНК полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, (при необходимости добавляется дополнительно MgCl2), который аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор, содержащий ДНК-матрицу. После чего добавляется Vent ДНК полимераза (предварительно разбавленная приложенным буфером для разбавления полимераз до концентрации 0.1 е.а./мкл) из расчета 1 мкл на 50 мкл реакционной смеси. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли и пробирки ставятся в амплификатор, предварительно нагретый до 95°C. В некоторых случаях фермент рекомендуется добавлять после первичной денатурации (2 мин, 95°C) и установления температуры 80°C (не вынимая пробирки из амплификатора). Этот метод постановки реакции повышает специфичность реакции за счет уменьшения вероятности появления побочных продуктов.

Вариант протокола постановки реакции с Vent ДНК полимеразой

  1. Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать.
  2. Держать пробирки с растворами в ледяной бане.
  3. Смешать в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане (на 50 мкл смеси):
    • Вода стерильная деионизованная – расчетное количество
    • 10X буфер для Vent полимеразы – 5 мкл
    • Смесь dNTP (2.5 мM) – 4 мкл
    • Смесь праймеров (прямой и обратный) (1 мкМ) – 10 мкл
    • ДНК-матрица (2 нг/мкл) – 5 мкл
    • 25 мМ раствор MgCl2 (при необходимости) – до 5-6 мМ
  4. Добавить 1 мкл Vent ДНК полимеразы, предварительно разбавленной в 20 раз буфером для разбавления полимераз (до 0.1 е.а./мкл)*
    Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
  5. Из ледяной бани быстро переставить пробирки в амплификатор, предварительно нагретый до 95°C. 6. Выдержать 2 мин при 95°C и начать ПЦР. 7. На завершающем этапе ПЦР выдержать пробирки 5 мин при 72°C.

* для повышения специфичности реакции можно добавлять Vent ДНК полимеразу после первичной денатурации (2 мин, 95°C) и установления температуры 80°C (не вынимая пробирки из амплификатора).

Праймеры

  • Праймеры для ПЦР обычно длиной 20-30 нуклеотидов.
  • Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру, находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование <праймер-димеров>.
  • 3’=>5′ экзонуклеазная активность, ассоциированная с Vent ДНК-полимеразой, может деградировать праймеры. Поэтому важно, чтобы Vent добавлялась в реакционную смесь последней. Деградация праймеров может быть эффективно предотвращена введением фосфоротиоатных связей на их 3′-конце [1].

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

Производимые ООО “СибЭнзайм” смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5 mM, 2.5 mM, и 4 mM, удобных для прямого использования в ПЦР.

Vent ДНК-полимераза.

Рекомендуемая концентрация около 0.1 единицы / 50 мкл.
Не используйте dUTP в ПЦР.

Предотвращение упаривания реакционной смеси

При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60°C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.

Vent имеет меньшую процессивность, чем Taq , поэтому рекомендуемое время составляет 1.5-2 мин на каждую тысячу пар нуклеотидов амплифицируемого фрагмента.

Завершающая стадия синтеза

После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72°C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5′ концов ПЦР продуктов комплементарной цепью.
Vent, в отличие от Taq ДНК полимеразы, не имеет активности терминальной трансферазы и производит ПЦР -продукты с тупыми концами, которые могут быть использованы в лигазной сшивке по тупым концам без дополнительной обработки концов.

Литература

1. Skerra, A., Phosphorothioate primers improve the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity, Nucleic Acids Res., 20, 3551-3554, 1992.