Протокол для ПЦР с Vent ДНК полимеразой

Приготовление реакционной смеси

Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят «мастер-микс», содержащий воду, буфер с MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, и праймеры в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор содержащий ДНК-матрицу. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли и пробирки ставятся в амплификатор. После первичной денатурации устанавливается температура 80 град Цельсия при которой(не вынимая пробирки из амплификатора) добавляется Vent ДНК полимераза (предварительно разбавленная приложенным буфером разбавления до концентрации 0.1 единица активности/мкл) из расчета 1мкл на 50(+5) мкл реакционной смеси. Этот метод постановки реакций не только сберегает время за счет уменьшения числа переноса реагентов и минимизирует возможность ошибок при пипетировании , но и повышает специфичность реакции за счет уменьшения вероятности появления побочных продуктов.

Процедура приготовления реакционной смеси

1. Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать .
2. Держать пробирки с растворами в ледяной бане.
3. Смешать, в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане:

  • Вода стерильная деионизованная
  • ДНК-матрица
  • 2.5mM dNTP смесь
  • Праймеры прямой и обратный
  • 10X Vent буфер
  • Vent ДНК-полимераза
  • 25mM MgCl2(при необходимости)

4. Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
5. Покрыть образец минеральным маслом (три четверти объема образца) либо подходящим количеством воска. Эта процедура может быть исключена, если амплификатор снабжен нагреваемой крышкой.
6. Поместить образцы в амплификатор, предварительно нагретый до 95°C и начать ПЦР.

Праймеры

  • Праймеры для ПЦР обычно длиной 20-30 нуклеотидов.
  • Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование <праймер-димеров>.
  • 3’=>5′ экзонуклеазная активность, ассоциированная с Vent ДНК-полимеразой может деградировать праймеры. Поэтому важно, чтобы Vent добавлялась в реакционную смесь последней. Деградация праймеров может быть эффективно предотвращена введением фосфоротиоатных связей на их 3′-конце [1].

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

Производимые НПО СибЭнзим смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5mM , 2.5mM , и 4 mM , удобных для прямого использования в ПЦР.

Vent ДНК-полимераза.

Рекомендуемая концентрация около 0.1 единицы / 50мкл.
Не используйте dUTP в пцр

Предотвращение упаривания реакционной смеси

При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60°C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.

Vent имеет меньшую процессивность, чем Taq , поэтому рекомендуемое время составляет 1.5-2 мин на каждуютысячу пар нуклеотидов амплифицируемого фрагмента.

Завершающая стадия синтеза

После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72°C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5 штрих концов ПЦР продуктов комплементарной цепью.
Vent, в отличие от Taq ДНК полимеразы, не имеет активности терминальной трансферазы и производит ПЦР -продукты с тупыми концами, которые могут быть использованы в лигазной сшивке по тупым концам без дополнительной обработки концов.

Литература

1. Skerra, A., Phosphorothioate primers improve the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity, Nucleic Acids Res., 20, 3551-3554, 1992.