Реакция обратной транскрипции

Приготовьте смесь РНК и праймера в следующих концентрациях:

• РНК: общая РНК 0.1-5мкг или поли(А) + мРНК 10нг-0.5мкг или специфичная РНК 0.01пг-0.5мкг
• Праймер: олиго(dТ)18 0.5мкг или random -праймер 0.2мкг или специфичный праймер 15-20пмоль
• Вода до объема 11 мкл

Инкубируйте смесь при 70 °С в течение 5 минут и охладите на льду.

Добавьте следующие компоненты:

• 10хБуфер 2мкл
• 10мМ смесь dNTP 2мкл (конечная концентрация-1мМ)
• Ингибитор РНКаз 20ед.
• Вода до объема 19 мкл

Инкубируйте реакционную смесь при 37 °С в течение 5 минут. Если используется random -праймер, то инкубируйте при 25 °С в течение 5 минут.

Добавьте 40 единиц M – MuLV обратной транскриптазы. Инкубируйте реакционную смесь, содержащую олиго(dТ)18 или специфичный праймер при 37 °С в течение 1 часа. Если используется random -праймер, то инкубируйте реакционную смесь при 25 °С в течение 10 минут, затем при 37 °С в течение 1 часа.

Остановите реакцию с помощью нагревания при 70 °С в течение 10 минут и затем поместив в лед.

Состав буфера для М-М uLV обратной транскриптазы (1хБуфер):

• 50мМ Трис-Н Cl ( pH 8.3),
• 75мМ KCl ,
• 3мМ MgCl2 ,
• 10 мМ DTT