Протокол для ПЦР с Pfu ДНК полимеразой
Процедура приготовления реакционной смеси
1 Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать .
2 Держать растворы в ледяной бане.
3 Смешать, в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане:
- Вода стерильная деионизованная
- ДНК-матрица
- 2.5mM dNTP смесь
- Праймеры прямой и обратный
- 10X Pfu буфер
- 25mM MgCl2(при необходимости)
- Раствор БСА
- Pfu ДНК-полимераза
4 Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
5 Покрыть образец минеральным маслом (три четверти объема образца) либо подходящим количеством воска. Эта процедура может быть исключена, если амплификатор снабжен нагреваемой крышкой.
6 Поместить образцы в амплификатор, предварительно нагретый до 95°C и начать ПЦР.
Праймеры
- Праймеры для ПЦР обычно длиной 20-30 нуклеотидов.
- Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование <праймер-димеров>.
- 3’=>5′ экзонуклеазная активность, ассоциированная с Pfu- ДНК-полимеразой может деградировать праймеры. Поэтому важно, чтобы Pfu- ДНК полимераза добавлялась в реакционную смесь последней. Деградация праймеров может быть эффективно предотвращена введением фосфоротиоатных связей на их 3′-конце (1).
Дезоксинуклеозидтрифосфаты
- Производимые НПО СибЭнзим смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5mM , 2.5mM , и 4 mM, удобных для прямого использования в ПЦР.
Pfu- ДНК полимераза
- Рекомендуемая концентрация около 2.5 единиц / 50мкл.
- Не используйте dUTP в пцр
Предотвращение упаривания реакционной смеси
При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60°C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.
Условия термоциклирования
Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.
Pfu- ДНК полимераза имеет меньшую процессивность, чем Taq , поэтому рекомендуемое время составляет 2 мин на каждую тысячу пар нуклеотидов амплифицируемого фрагмента.
Завершающая стадия синтеза
- После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72°C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5 штрих концов ПЦР продуктов комплементарной цепью.
- Pfu- ДНК полимераза, в отличие от Taq- ДНК полимеразы, не имеет активности терминальной трансферазы и производит ПЦР – продукты с тупыми концами.
Литература
1. Skerra, A., Phosphorothioate primers improve the amplification of DNA sequences by DNA polymerases with proofreading activity, Nucleic Acids Res., 20, 3551-3554, 1992.