Bls I

Название ферментаBls I
ПрототипBlsI
АртикулSE-E533
Вариант TurboОтсутствует
Высококонцентрированная версияОтсутствует
Тип рестриктазыТип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания.
Сайт узнаванияНеверный формат сайта узнавания
ИсточникBacillus simplex 23
Оптимальный буферSE-буфер W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура30 °C
Температура инактивации65 °C
Активность в буферах
BGOWYROSE
1010501007550
Определение единицы активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза, как минимум, одного сайта 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5` в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Определение активности BlsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Bls I 3: 0.5 мкл Bls I (1/5) 4: 1 мкл Bls I (1/5) 5: 2 мкл Bls I (1/5) 6: 1 мкл неразбавленного фермента Bls I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Определение активности BlsI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2: 0 мкл Bls I
3: 0.5 мкл Bls I (1/5)
4: 1 мкл Bls I (1/5)
5: 2 мкл Bls I (1/5)
6: 1 мкл неразбавленного фермента Bls I

Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Bls I
Субстрат для определения активностиСубстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три канонических сайта: 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5` [2, 3].
Условия хранения10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Неспецифический гидролизНе наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 5 ед фермента Bls I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется10 Х SE-буфер W.
Литература
  2. М.А. Абдурашитов, А.Н. Куксова, А.Г. Акишев, Е.В. Землянская, С.Х. Дегтярев MteI-ПЦР-анализ-новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 3 ,с. 15-23 (2013).
  3. В.А. Чернухин, Д.А. Гончар, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярев Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5` -RYNRY- 3` при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38 (2013).
  7. В.А. Чернухин, Ю.Э. Томилова, Е.В. Чмуж, О.О. Соколова, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, Т3, №1, С. 28-33 (2007).
  8. Е.В. Чмуж, Ю.Г. Каширина, Ю.Э. Томилова, В.А. Чернухин, С.С. Охапкина, Д.А. Гончар, В.С. Дедков, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007).
  10. В.А. Чернухин, Ю.Э. Томилова, Е.В. Чмуж, О.О. Соколова, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Штамм бактерий Bacillus simplex - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bls I // Патент на изобретение RU 2322494 С1 (2006).
// Код для некролога