Gla I

Название фермента Gla I
Прототип GlaI
Артикул SE-E493
Вариант Turbo Отсутствует
Высококонцентрированная версия Отсутствует
Тип рестриктазы Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания.
Сайт узнавания
5'… R(5mC)▼GY …3'
3'… YG▲(5mC)R …5'
Источник Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Gla I из Glacial ice bacterium Gl29
Оптимальный буфер SE-буфер Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)
Оптимальная температура 30 °C
Температура инактивации 65 °C
Активность в буферах
BGOWYROSE
75752525100100
Определение единицы активности За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг плазмиды pHspAI2/GsaI по единственному сайту 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5` за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pHspAI2/GsaI и образование двух основных (3,419 и 699 п.н.) фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCGC-3`/3`-CGCG-5`, имеющим три и два 5-метилцитозина. Определение активности GlaI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI2/GsaI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 2 - Контрольная ДНК pHspAI2/GsaI, 3 - 0.5 мкл GlaI (разб. 1/100), 4 - 1 мкл GlaI (разб. 1/100), 5 - 2 мкл GlaI (разб. 1/100), 6 - 1 мкл неразбавленного фермента GlaI, 1 и 7- 1 Kb SE ДНК-маркеры. Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE. Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE. В присутствии 20% DMSO активность фермента значительно возрастает по всем сайтам без потери специфичности
Определение активности GlaI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI2/GsaI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
2 - Контрольная ДНК pHspAI2/GsaI,
3 - 0.5 мкл GlaI (разб. 1/100),
4 - 1 мкл GlaI (разб. 1/100),
5 - 2 мкл GlaI (разб. 1/100),
6 - 1 мкл неразбавленного фермента GlaI,
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.

Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE.

В присутствии 20% DMSO активность фермента значительно возрастает по всем сайтам без потери специфичности
Gla I
Субстрат для определения активности Субстрат pHspAI2/GsaI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI2, [modal_dna seq="phspai2.txt" title="Быстрый просмотр"] линеаризованной эндонуклеазой рестрикции GsaI. Плазмида pHspAI2 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species A1, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.HspAI, и единственный канонический сайт узнавания GlaI 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5` [2].
Условия хранения 10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1% Triton X-100, 50 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование
Неспецифический гидролиз Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 100 ед фермента Gla I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет ДНК, содержащую N4-метилцитозин [1].
С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y, плазмида pHspAI2/GsaI.
Примечания
Литература
  3. Сторонняя публикация Qiaomin Wu, Yang Yu, Mengqi Chen, Jinyan Long, Xiaolan Yang A label-free fluorescence sensing strategy based on GlaI-assisted EXPAR for rapid and accurate quantification of human methyltranferase activity // Talanta, 269, 125456 (2024)
  4. Сторонняя публикация Xu, G., Yang, H., Qiu, J. et al. Sequence terminus dependent PCR for site-specific mutation and modification detection. // Nature Communications 14, 1169 (2023)
  6. Сторонняя публикация Zhou S, Sun H, Huo D, Wang X, Qi N, Peng L, Yang M, Lu P, Hou C. A novel methyl-dependent DNA endonuclease GlaI coupling with double cascaded strand displacement amplification and CRISPR/Cas12a for ultra-sensitive detection of DNA methylation. // Analytica Chimica Acta, Volume 1212, 15 June 2022
  7. Сторонняя публикация Dong N, Wang W, Qin Y, Wang Y, Shan H. Sensitive lateral flow assay for bisulfite-free DNA methylation detection based on the restriction endonuclease GlaI and rolling circle amplification // Analytica Chimica Acta, Volume 1227, 22 September 2022
  9. А.Г. Акишев, Н.А. Нетесова, М.А. Абдурашитов, И.В. Вихлянов, М.К. Никитин, А.Б. Карпов, С.Х. Дегтярев Оценка риска возникновения рака молочной железы и рака желудка путем определения вариантов полиморфизма 5mC/T в интроне гена KIF26B в положении хр1: 245618129 // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2019.78.40307 (2021).
  12. Б.С. Малышев, Н.А. Нетесова, Н.А. Сметанникова, М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, Е.В. Дубинин, А.З. Азанов, И.В. Вихлянов, М.К. Никитин, А.Б. Карпов, С.Х. Дегтярев GlaD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудка // Acta Naturae, 2020, том 12, № 3(46): 124-133 (2020).
  13. Сторонняя публикация Petrova, D. V., Naumenko, M. B., Khantakova, D. V., Grin, I. R. & Zharkov, D. O. Relative Efficiency of Recognition of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine by Methyl-Dependent DNA Endonuclease GlaI // Russian Journal of Bioorganic Chemistry T. 45, № 6, стр. 625-629. (2019)
  14. В.А. Чернухин, В.С. Дедков, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, Т.Н. Наякшина, Е.Н. Ломаковская, С.Х. Дегтярев Сравнение субстратной специфичности рекомбинантной сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и нативного фермента, выделенного из штамма Glacial ice bacterium // ДНК-узнающие ферменты , DOI: 10.26213/SE.2019.81.28075 (2019).
  15. А.Г. Акишев, Н.А. Нетесова, М.А. Абдурашитов, И.В. Вихлянов, М.К. Никитин, А.Б. Карпов, С.Х. Дегтярев GlaI-ПЦР анализ метилирования сайта ACGC в хp11: 65647266 в препаратах ДНК клеток крови в норме и на ранних стадиях рака молочной железы // Эпигенетическая ДНК диагностика, DOI: 10.26213/SE.2019.66.12.001 (2019).
  18. Сторонняя публикация Susan M Mitchell, Keith N Rand, Zheng-Zhou Xu, Thu Ho, Glenn S Brown, Jason P Ross, Peter L Molloy Helper-Dependent Chain Reaction (HDCR) for Selective Amplification of Methylated DNA Sequences // Methods Mol Biol (2018)
  19. Сторонняя публикация Yueying Sun, Yuanyuan Sun, Weimin Tian, Chenghui Liu, * Kejian Gao and Zhengping L A novel restriction endonuclease GlaI for rapid and highly sensitive detection of DNA methylation coupled with isothermal exponential amplification reaction // Chemical Science, 9, pp.1344-1351 (2018)
  24. А.А. Евдокимов, Н.А. Нетесова, Н.А. Сметанникова, М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, Е.С. Давидович, В.В. Кузнецов, Ю.Д. Ермолаев, А.Б. Карпов, А.Э. Сазонов, Р.М. Тахауов, С.Х. Дегтярев Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке // Вопросы онкологии, №1, стр. 116-120. (2016)
  30. М.А. Абдурашитов, А.Н. Куксова, А.Г. Акишев, Е.В. Землянская, С.Х. Дегтярев MteI-ПЦР-анализ-новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 3 ,с. 15-23 (2013).
  31. Сторонняя публикация Keith N. Rand, Graeme P. Young, Thu Ho and Peter L. Molloy Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylationdependent restriction enzymes. // Nucleic Acids Research, pp. 1-10 (2012).
  32. Сторонняя публикация F. Syeda, R.L. Fagan, M. Wean, G.V. Awakumov, J.R. Walker, S. Xue, S. Dhe-Paganon, & C. Brenner The RFTS Domain is a DNA-competitive Inhibitor of Dnmt1 // , JBC, v. 286, pp. 15344-15351 (2011).
  34. Сторонняя публикация Kravets AP, Mousseau TA, Litvinchuk AV, Ostermiller Sh, Vengen GS, Grodzinski DM Changes in wheat DNA methylation pattern after chronic seed gamma-irradiation. // Tsitol Genet. 2010 Sep-Oct;44(5):18-22. Russian.
  37. Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев. Способ определения гиперметилированных CpG островков в области генов-супрессоров опухолевого роста в ДНК человека. // Патент на изобретение RU 2413773 С1 (2009).
  41. Ю.Э. Томилова, В.А. Чернухин, С.Х. Дегтярев Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5′-GCGC-3′. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, т.2, №1 (2006) с. 30-39.
  42. В.А. Чернухин, Т.Н. Наякшина, Н.В. Мезенцева, Ю.Э. Томилова, С.Х. Дегтярев, В.С. Дедков Штамм бактерий Glacial ice bacterium I - продуцент эндонуклеазы рестрикции Gla I // Патент на изобретение RU 2287012 С1 (2005).
// Код для некролога