Pcs I

Название фермента Pcs I
Прототип PcsI
Артикул SE-E505
Вариант Turbo Отсутствует
Высококонцентрированная версия Отсутствует
Тип рестриктазы Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания.
Сайт узнавания
5'… (5mC)GNNNNN▼NN(5mC)G …3'
3'… G(5mC)NN▲NNNNNG(5mC) …5'
Источник Из штамма E.coli, несущего клонированный ген PcsI I из Paracoccus carotinifaciens 3K.
Оптимальный буфер SE-буфер 3M
Оптимальная температура 37 °C
Температура инактивации 65 °C
Активность в буферах
BGOWYROSE
50500105050
Определение единицы активности За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpySE49/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHpySE49/DriI и образование двух фрагментов ДНК. Определение активности PcsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpySE49/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2 - исходная ДНК pMHpySE49/DriI 3 - 0.25 мкл Pcs I 4 - 0.5 мкл Pcs I 5 - 1 мкл Pcs I 6 - 2 мкл Pcs IПродукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Определение активности PcsI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpySE49/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.

Дорожки:
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры.
2 - исходная ДНК pMHpySE49/DriI
3 - 0.25 мкл Pcs I
4 - 0.5 мкл Pcs I
5 - 1 мкл Pcs I
6 - 2 мкл Pcs I

Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.
Pcs I
Субстрат для определения активности Плазмидная ДНК pMHpySE49, линеаризованная DriI (pMHpySE49/DriI). pMHpySE49 (3536 п.н.) получена путем лигирования вектора pMTL22/FauNDI/SmaI и ПЦР-фрагмента, содержащего ген метилазы M.HpySE526I (образует 5'-A(5mC)GT-3') и последовательность ДНК 5'-GACGTATAAAACGTT-3' 3'-CTGCATATTTTGCAA-5' В результате, данный субстрат имеет оптимальный сайт PcsI: 5'-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3' 3'-TG(5mC)NNNNNNNG(5mC)A-5'
Условия хранения 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 7 mM 2-меркаптоэтанол, 100 μg/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование
Неспецифический гидролиз Неспецифического гидролиза не наблюдается при обработке 1 мкг ДНК фага лямбда 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. После инкубации 5 ед фермента в течение 3 часов неспецифического гидролиза одно- и двуцепочечного олигонуклеотидов не наблюдается.
Чувствительность к метилированию Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.
С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер 3M PcsI
Примечания
Литература
  1. В.А. Чернухин, Т.Н. Наякшина, Г.В. Тарасова, Л.Н. Голикова, А.Г. Акишев, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2008).
// Код для некролога