Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5`-GCN^GC-3`/3`-CG^NCG-5`, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов.
// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7 , № 3 ,с. 35-42 (2011).
Pkr I
| Название фермента | Pkr I | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Прототип | PkrI | ||||||||||||
| Артикул | SE-E579 | ||||||||||||
| Вариант Turbo | Отсутствует | ||||||||||||
| Высококонцентрированная версия | Отсутствует | ||||||||||||
| Тип рестриктазы | Тип IIMiФерменты типа IIM требуют модифицированный, обычно метилированный, сайт узнавания для разрезания., Тип IIPiФерменты типа IIP — классические рестриктазы типа II с палиндромными сайтами узнавания и симметричными сайтами разрезания. | ||||||||||||
| Сайт узнавания | 5'… G(5mC)N▼G(5mC) …3' 3'… (5mC)G▲N(5mC)G …5' |
||||||||||||
| Источник | Planomicrobium koreense 78k | ||||||||||||
| Оптимальный буфер | SE-буфер Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) | ||||||||||||
| Оптимальная температура | 37 °C | ||||||||||||
| Температура инактивации | 65 °C | ||||||||||||
| Активность в буферах |
|
||||||||||||
| Определение единицы активности | За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси (см. рисунок ниже, дор. 4). Определение активности PkrI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Pkr I 3: 0.5 мкл Pkr I 4: 1 мкл Pkr I 5: 2 мкл Pkr I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.. | ||||||||||||
Определение активности PkrI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 - 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Pkr I 3: 0.5 мкл Pkr I 4: 1 мкл Pkr I 5: 2 мкл Pkr I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE.  | |||||||||||||
| Субстрат для определения активности | Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три сайта: 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5` [2]. | ||||||||||||
| Условия хранения | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. | ||||||||||||
| Лигирование | |||||||||||||
| Неспецифический гидролиз | Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 2 ед фермента Pkr I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||||
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет только метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК [1]. | ||||||||||||
| С ферментом поставляется | 10 Х SE-буфер Y. | ||||||||||||
| Примечания | |||||||||||||
| Литература | |||||||||||||