Description
Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2
Описание:
Термолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
Определение единицы активности:
За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат.
Оптимальный буфер: SE-буфер W
Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин.
Хранить при -20°С.
Примечание:
Термолабильную щелочную фосфатазу не рекомендуется разбавлять ввиду возможной потери активности.
Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III.
Протокол дефосфорилирования 5′-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР):
На 20 мкл реакционной смеси:
- 10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) – 2 мкл,
- ДНК – 0,5-1мкг,
- деионизованная вода – до 20 мкл.
Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием.
Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре.
Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!!
Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием.
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%).
Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин.
Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов. Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.
