Протокол для проведения ПЦР с Taq SE ДНК полимеразой

Приготовление реакционной смеси

Для выполнения нескольких параллельных реакций готовят “мастер-микс”, содержащий воду, буфер с MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, и праймеры в одной пробирке, который затем аликвотируется по индивидуальным пробиркам. Затем добавляется раствор содержащий ДНК-матрицу. Если не используется амплификатор с нагреваемой крышкой, то поверх реакционной смеси наслаивается минеральное масло. В настольной центрифуге сбрасываются капли и пробирки ставятся в амплификатор. После первичной денатурации устанавливается температура 80 град Цельсия при которой(не вынимая пробирки из амплификатора) добавляется Taq SE ДНК полимераза из расчета 1 единица на 50(+5) мкл реакционной смеси. Этот метод постановки реакций не только сберегает время за счет уменьшения числа переноса реагентов и минимизирует возможность ошибок при пипетировании , но и повышает специфичность реакции за счет уменьшения вероятности появления побочных продуктов.

Процедура приготовления реакционной смеси

1. Все пробирки с растворами после оттаивания мягко потрясти и коротко отцентрифугировать .
2. Держать пробирки с растворами в ледяной бане (внимание!: не на льду!).
3. Смешать, в тонкостенной пробирке для ПЦР, находящейся в ледяной бане:

  • Вода стерильная деионизованная
  • ДНК-матрица
  • 2.5mM dNTP смесь
  • Праймеры прямой и обратный
  • 10X TaqSE буфер
  • 25mM MgCl2(при необходимости)
  • TaqSE ДНК-полимераза

4. Мягко перемешать образец и коротко отцентрифугировать для сбора всех капель со стен пробирки.
5. Покрыть образец минеральным маслом (три четверти объема образца) либо подходящим количеством воска. Эта процедура может быть исключена, если амплификатор снабжен нагреваемой крышкой.
6. Поместить образцы в амплификатор и начать ПЦР.

Праймеры

Среди различных рекомендаций по подбору праймеров наиболее существенными, на наш взгляд, являются следующие:

  • Праймеры для ПЦР обычно длиной 17-28 нуклеотидов. Более длинные праймеры обеспечивают повышенную специфичность.
  • Праймер не должен быть самокомплементарным или комплементарным к любому другому праймеру находящемуся в реакционной смеси. Это предотвращает образование “праймер-димеров”.
  • Температура отжига обычно ниже температуры плавления примерно на 5°C.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты

  • Производимые НПО СибЭнзим смеси dNTP представлены в концентрациях 0.5mM , 2.5mM , и 4 mM , удобных для прямого использования в ПЦР.
    Taq SE ДНК-полимераза.

Обычно 0.8-1.2u Taq SE ДНК полимеразы используется в 50чl реакционной смеси. Более высокие концентрации Taq SE могут вызывать синтез неспецифических продуктов.

Предотвращение упаривания реакционной смеси

При необходимости, реакционная смесь может быть покрыта (квалификация чистоты: <для использования в ПЦР>) парафином (с температурой плавления 50-60°C) либо минеральным маслом. Трех четвертей от общего объема реакционной смеси обычно достаточно.

Условия термоциклирования

Параметры амплификации сильно зависят от матрицы, праймеров и типа используемого амплификатора.

Завершающая стадия синтеза

После последнего цикла, образцы обычно выдерживают при 72°C в течение 5-15 мин для заполнения выступающих 5 штрих концов ПЦР продуктов комплементарной цепью.

Если полоса продукта ПЦР в окрашенном бромистым этидием агарозном геле размазана, выполняются следующие действия, по отдельности либо в сочетании: уменьшение концентрации фермента, ионов магния, удлинение времени либо повышение температуры денатурации, уменьшение общего числа циклов, и уменьшение возможности загрязнения.
Примеси в препаратах ДНК-матрицы могут изменять pH ПЦР, а также прямо ингибировать полимеразу.