Протоколы для ДНК полимеразы I E.coli (Фрагмент Кленова)

  1. Протокол 3’-концевого мечения двуцепочечной линеной ДНК путем достройки выступающих 5’-концов.

Реакционная смесь (20 мкл):

Линейная (гидролизованная) ДНК (водный раствор) 0,1-4 мкг;
Реакционный буфер для Фрагмента Кленова (10Х) 2 мкл;
Меченый [alpha-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol (400-800 Ci/mmol) 0,74 MBq (20 µCi)
или [alpha-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000 Ci/mmol) 2,96 MBq (80 µCi);
Смесь трех dNTP, 2 mM каждого (за исключением меченого dNTP) (0,25 mM конечная концентрация); 2,5 мкл
Стерильная вода до 20 мкл
Фрагмент Кленова 0,2-1 мкл (1-5 единиц);

 

Инкубировать смесь при 37°C в течение 15 мин.

Остановить реакцию прогреванием при 75°C в течение 10 мин.

 

 

  1. «Затупление» гидролизованной двуцепочечной ДНК путем достройки 5’-выступающих и удаления 3’-выступающих концов.

Реакционная смесь (20 мкл):

Линейная (гидролизованная) ДНК (водный раствор) 0,1-4 мкг;
Реакционный буфер для Фрагмента Кленова (10Х) 2 мкл;
Смесь четырех dNTP*, 2 mM каждого (0,1 mM конечная концентрация);

 

 1 мкл
Стерильная вода до 20 мкл
Фрагмент Кленова 0,2-1 мкл (1-5 единиц);

 

Инкубировать смесь при 37°C в течение 10 мин или при 25°C в течение 20 мин.

Остановить реакцию прогреванием при 75°C в течение 10 мин.

 

*Примечание. Можно проводить частичную достройку 5’-выступающих концов, добавляя только необходимые dNTP, например:

 

NNN-3’                                                                                             NNNGA-3’                                                                    

NNNCTAG-5’    +     dATP и dGTP + Klenow Fr.     =       NNNCTAG-5’