Протокол реакции с Т4 ДНК-полимеразой

ДНК-полимераза фага Т4 обладает 5’→3’ полимеразной и 3’→5’ экзонуклеазной активностями.
По уровню 3’→5’ коррекции ошибок она >200× активнее Фрагмента Кленова; активность сильнее на одноцепочечной ДНК.
Используется для «затупления» концов ДНК (достройка 5’-выступов при наличии dNTP и/или удаление 3’-выступов за счёт экзонуклеазы),
включая ПЦР-фрагменты с 3’-dA-выступами. По точности репликации делает ~в 10 раз меньше ошибок, чем Фрагмент Кленова,
однако последний способен к реакции замещения цепи. Возможны применения в сайт-направленном мутагенезе и мечении концов ДНК [1].

Рекомендуемые условия «затупления»

Концентрация dNTP
по 100 мкМ каждого
Дозировка фермента
1–3 ед. Т4 ДНК-полимеразы на 1–2 мкг ДНК
Инкубация (щадящая)
12–15 °C, 15–20 мин
Инкубация (быстрая)
37 °C, 5 мин

Стандартная реакция (20 мкл)

Компонент Количество / конечная Комментарий
SE-буфер для Т4 ДНК-полимеразы (10×) 2 мкл 1× в реакции
Линейная ДНК или ПЦР-фрагмент ~1 мкг
Смесь dNTP (2 мМ каждого) 1 мкл до 100 мкМ каждого в реакции
Т4 ДНК-полимераза 1–3 ед. активности
Стерильная вода до 20 мкл Nuclease-free

Пошаговая процедура

  1. Соберите реакцию на льду согласно таблице (20 мкл). Аккуратно перемешайте, сбросьте капли центрифугирование.
  2. Инкубируйте при 12–15 °C, 15–20 мин или при 37 °C, 5 мин.
  3. Остановка реакции: добавьте ЭДТА до 10 мМ и прогрейте 10 мин при 75 °C,
    или инактируйте фенол/хлороформной обработкой.
Примечание: избыток фермента и/или длительная инкубация могут привести к деградации концов ДНК
вследствие 3’→5’ экзонуклеазной активности. Соблюдайте рекомендуемые дозы и время.

Литература

[1] Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.