Протокол реакции с Т4 РНК лигазой (оцРНК лигазой)

Общие рекомендации

В качестве субстратов Т4 РНК лигазы (оцРНК лигазы) могут быть использованы одноцепочечные ДНК и РНК длиной более двух нуклеотидов. Область применения фермента: – интер- и интрамолекулярное сшивание молекул РНК и ДНК; – синтез одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов; – мечение 3’-конца РНК с помощью 5’-[32P] pCp.
В состав реакционного буфера для Т4 РНК лигазы входит АТФ. Поэтому буфер не следует размораживать много раз во избежание многократного выпадения АТФ в осадок. При первой разморозке буфера рекомендуется слегка нагреть его (до 35-37 °С) и несколько раз встряхнуть до полного растворения осадка. Затем расфасовать его небольшими объемами (20-50 мкл) в отдельные пробирки, заморозить и использовать эти аликвоты не более 2-3 раз. Допускается хранение размороженного буфера при +4 °С в течение 7 дней.

1.Лигирование одноцепочечных фрагментов РНК с помощью Т4 РНК лигазы (стандартный протокол)

На 10 мкл реакционной смеси:

• Реакционный буфер (десятикратный) – 1 мкл;
• Фрагмент 1 (0.1-1 мг/мл) – 1-3 мкл;
• Фрагмент 2 (0.1-1 мг/мл) – 1-3 мкл; Вода (Milli-Q) – до конечного объема 10 мкл

__________________________________

• + 1-2 мкл (10-20 ед.) Т4 РНК лигазы.

Инкубировать в течение 16 ч при 16 °С или 1-3 часа при 37 °С.

При необходимости, инактивировать фермент прогревом в течение 15 мин при 65 °C.

2. Мечение 3’-конца фрагмента РНК с помощью Т4 РНК лигазы

На 30 мкл реакционной смеси:

• Реакционный буфер (десятикратный) – 1 мкл;
• РНК (1 мг/мл) – 1 мкл;
• ДМСО – 3 мкл (10% v/v); 1 мкМ [32P] pCp; Вода (Milli-Q) – до конечного объема 30 мкл

_____________________________

• + 2 мкл (20 ед.) Т4 РНК лигазы.

Инкубировать в течение 16 ч при 16 °С.