Расщепление различных субстратов препаратами ферментов Эндонуклеазы I

(ENase I, Кат.№ E323/E324) и Sma-эндонуклеазы (Sma-ENase, Кат.№ E321/E322).

 

1. Гидролиз очищенных субстратов

Условия реакции:

Реакционная смесь для ENase I (на 20 мкл):

  • 10Х SE Buffer “Эндонуклеаза I”                        –  2 мкл;
  • ДНК или тРНК                                                     – 1 мкг;
  • Стерильная H2O                                                   – до 20 мкл.

 

Реакционная смесь для Sma-ENase (на 20 мкл):

  • 10Х SE Buffer “B”                                                –  2 мкл;
  • ДНК или тРНК                                                     – 1 мкг;
  • Стерильная H2O                                                   – до 20 мкл.

 

В качестве субстратов использовали: геномную ДНК E.coli, геномную ДНК клеточной линии человека U-937, ДНК плазмиды pUC19, суммарную тРНК E.coli. В пробирки с реакционной смесью добавляли по 1 мкл (50 е.а.) ENase I или по 1 мкл (100 е.а.) Sma-ENase. Смеси инкубировали в течение 10 мин при 37oC.

Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 10X “Стоп-буфера” (0,01% бромфеноловый синий; 0,25 M EDTA; 50% сахароза) и помещали пробирки в морозильную камеру на -20oC на 30 мин.

Затем реакционные смеси размораживали, наносили по 10 мкл на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в буфере TАE.

На рисунке 1 приведены результаты электрофореза продуктов гидролиза:

Рис.1. Гидролиз различных субстратов препаратами ENase I и Sma-ENase

Дорожки:

1-3 – геномная ДНК E.coli; 4-6 – геномная ДНК клеточной линии человека U-937;

7-9 – ДНК плазмиды pUC19; 10-12 – суммарная тРНК E.coli;

1,4,7 и 10 – исходные субстраты;

2,5,8 и 11 – гидролизаты препаратом ENase I;

3,6,9 и 12 – гидролизаты препаратом Sma-ENase;

13 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

Видно, что после обработки ферментами субстраты исчезают, то есть обе эндонуклеазы эффективно расщепляют препараты ДНК и РНК до мелких фрагментов.

 

2. Удаление нуклеиновых кислот из грубого лизата клеток E.coli препаратом фермента ENase I

  

Условия реакции:

Реакционная смесь №1 для ENase I (на 20 мкл):

  • 10X SE Buffer “Эндонуклеаза I”                                                                   –  2 мкл;
  • Грубый лизат клеток E.coli после обработки ультразвуком                      – 5 мкл;
  • Стерильная H2O                                                                                              – 13 мкл.

Готовили два ряда по четыре 0,5 мл пробирки с 20 мкл реакционной смеси №1. В три пробирки (1-5, 1-10, 1-20) в каждом ряду добавляли по 2 мкл (100 е.а.) ENase I, в четвертую, контрольную, пробирку (К1) фермент не добавляли. Пробирки инкубировали при 37oC в течение 5 мин (№1-5), 10 мин (№1-10) или 20 мин (№1-20 и К1).

Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 10X “Стоп-буфера” (0,01% бромфеноловый синий; 0,25 M EDTA; 50% сахароза). Четыре пробирки из первого ряда сразу помещали в морозильную камеру на -20oC на 30 мин, а пробирки из второго ряда прогревали при 65oC в течение 10 мин, после чего их тоже помещали в морозильную камеру на -20oC.

Продукты реакции наносили по 10 мкл на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в буфере TАE.

На рисунке 2 приведены результаты электрофореза продуктов гидролиза нуклеиновых кислот в грубом лизате клеток E.coli препаратом ENase I без прогрева и с прогревом при 65oC.

Рис.2. Удаление нуклеиновых кислот из грубого лизата клеток E.coli препаратом ENase I

Дорожки:

1-3 – геномная ДНК E.coli; 4-6 – геномная ДНК клеточной линии человека U-937;

7-9 – ДНК плазмиды pUC19; 10-12 – суммарная тРНК E.coli;

1,4,7 и 10 – исходные субстраты;

2,5,8 и 11 – гидролизаты препаратом ENase I;

3,6,9 и 12 – гидролизаты препаратом Sma-ENase;

13 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

Дорожки:

1-4 – без прогрева реакционной смеси; 6-9 – с прогревом смеси при 65oC;

1,6 – исходная реакционная смесь с грубым лизатом клеток;

2,7 – гидролизат препаратом ENase I через 5 мин;

3,8 – гидролизат препаратом ENase I через 10 мин;

4,9 – гидролизат препаратом ENase I через 20 мин;

5,10 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

3. Удаление нуклеиновых кислот из грубого лизата клеток E.coli препаратом фермента Sma-ENase

 

Условия реакции:

Реакционная смесь №2 для Sma-ENase (на 20 мкл):

  • 10X SE Buffer “B”                                                                                                                      –  2 мкл;
  • Грубый лизат клеток E.coli после обработки ультразвуком                      – 5 мкл;
  • Стерильная H2O                                                                                                                     – 13 мкл

Готовили два ряда по четыре 0,5 мл пробирки с 20 мкл реакционной смеси №2. В три пробирки (2-5, 2-10, 2-20) в каждом ряду добавляли по 1 мкл (100 е.а.) Sma-ENase, в четвертую, контрольную, пробирку (К2) фермент не добавляли. Пробирки инкубировали при 37oC в течение 5 мин (№2-5), 10 мин (№2-10) или 20 мин (№2-20 и К2).

Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 10X “Стоп-буфера” (0,01% бромфеноловый синий; 0,25 M EDTA; 50% сахароза). Четыре пробирки из первого ряда сразу помещали в морозильную камеру на -20oC на 30 мин, а пробирки из второго ряда прогревали при 65oC в течение 10 мин, после чего их тоже помещали в морозильную камеру на -20oC.

Продукты реакции наносили по 10 мкл на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в буфере TАE..

На рисунке 3 приведены результаты электрофореза продуктов гидролиза нуклеиновых кислот в грубом лизате клеток E.coli препаратом Sma-ENase без прогрева и с прогревом при 65oC.

Рис.3. Удаление нуклеиновых кислот из грубого лизата клеток E.coli препаратом Sma-ENase

Дорожки:

1-3 – геномная ДНК E.coli; 4-6 – геномная ДНК клеточной линии человека U-937;

7-9 – ДНК плазмиды pUC19; 10-12 – суммарная тРНК E.coli;

1,4,7 и 10 – исходные субстраты;

2,5,8 и 11 – гидролизаты препаратом ENase I;

3,6,9 и 12 – гидролизаты препаратом Sma-ENase;

13 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

Дорожки:

1-4 – без прогрева реакционной смеси; 6-9 – с прогревом смеси при 65oC;

1,6 – исходная реакционная смесь с грубым лизатом клеток;

2,7 – гидролизат препаратом ENase I через 5 мин;

3,8 – гидролизат препаратом ENase I через 10 мин;

4,9 – гидролизат препаратом ENase I через 20 мин;

5,10 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

Дорожки:

1-4 – без прогрева реакционной смеси; 6-9 – с прогревом смеси при 65oC;

1,6 – исходная реакционная смесь с грубым лизатом клеток;

2,7 – гидролизат препаратом Sma-ENase через 5 мин;

3,8 – гидролизат препаратом Sma-ENase через 10 мин;

4,9 – гидролизат препаратом Sma-ENase через 20 мин;

5,10 – 1 Kb SE ДНК маркеры (0,25-10 т.п.н.).

Видно, что оба фермента эффективно удаляют нуклеиновые кислоты из грубого лизата, при этом прогрев реакционной смеси при 65oC в течение 10 мин после окончания реакции существенно улучшает результат.

 

Эффективность работы препаратов Эндонуклеазы I и Sma-эндонуклеазы в шести основных SE буферах для эндонуклеаз рестрикции была проверена на ДНК фага Лямбда. Результаты приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Активность препаратов Эндонуклеазы I (ENase I) и Sma-эндонуклеазы (Sma-ENase) в шести основных SE буферах для эндонуклеаз рестрикции (в % от максимальной).

 

SE Буфер B G O W Y ROSE
ENase I 75-100 50-75 75-100 75-100 75-100 100
Sma-ENase 100 75-100 50-75 50-75 75-100 50-75

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Эндонуклеаза I и Sma-эндонуклеаза могут применяться для полного расщепления ДНК и РНК до коротких фрагментов, в том числе для удаления нуклеиновых кислот из клеточных или бактериальных лизатов, что позволяет снизить вязкость раствора и облегчает последующие операции по очистке или экстракции белков. Прогревание реакционной смеси с лизатами при 65oC по окончании реакции гидролиза улучшает результат обработки. Оба фермента способны эффективно работать во всех буферах для эндонуклеаз рестрикции.