Расщепление различных субстратов препаратами ферментов Эндонуклеазы I
(ENase I, Кат.№ E323/E324) и Sma-эндонуклеазы (Sma-ENase, Кат.№ E321/E322).
1. Гидролиз очищенных субстратов
Условия реакции:
Реакционная смесь для ENase I (на 20 мкл):
- 10Х SE Buffer “Эндонуклеаза I” – 2 мкл;
- ДНК или тРНК – 1 мкг;
- Стерильная H2O – до 20 мкл.
Реакционная смесь для Sma-ENase (на 20 мкл):
- 10Х SE Buffer “B” – 2 мкл;
- ДНК или тРНК – 1 мкг;
- Стерильная H2O – до 20 мкл.
В качестве субстратов использовали: геномную ДНК E.coli, геномную ДНК клеточной линии человека U-937, ДНК плазмиды pUC19, суммарную тРНК E.coli. В пробирки с реакционной смесью добавляли по 1 мкл (50 е.а.) ENase I или по 1 мкл (100 е.а.) Sma-ENase. Смеси инкубировали в течение 10 мин при 37oC.
Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 10X “Стоп-буфера” (0,01% бромфеноловый синий; 0,25 M EDTA; 50% сахароза) и помещали пробирки в морозильную камеру на -20oC на 30 мин.
Затем реакционные смеси размораживали, наносили по 10 мкл на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в буфере TАE.
На рисунке 1 приведены результаты электрофореза продуктов гидролиза: