Протокол обработки ДНК щелочной фосфатазой
Общие рекомендации:
Наиболее часто щелочная фосфатаза применяется для удаления фосфатных групп с 5’-концов фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза эндонуклеазами рестрикции. Поскольку дефосфорилированные концы не сшиваются ДНК-лигазой, то такая обработка позволяет предотвратить самолигирование фрагментов ДНК, например, плазмидных векторов, предназначенных для последующего клонирования. Принцип действия щелочной фосфатазы из кишечника теленка (CIP) (E327, E328) и термолабильной щелочной фосфатазы из арктической бактерии Alteromonas undina P2 (E365, E366) одинаков. Главное отличие состоит в том, что термолабильная фосфатаза инактивируется прогреванием реакционной смеси при 65 °C в течение 10 мин, что позволяет избежать такой процедуры, как очистка ДНК фенолом-хлороформом, которую необходимо выполнить, работая с традиционной термостабильной фосфатазой из кишечника теленка. Обе фосфатазы способны работать во всех стандартных SE буферах, предназначенных для эндонуклеаз рестрикции, что дает возможность просто добавлять фосфатазу в реакционную смесь в процессе гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции. Более слабо активность фосфатаз проявляется в бессолевом буфере “B”. В этом случае после проведения гидролиза ДНК рекомендуется высадить 96%-ным этанолом, а затем провести обработку концов фосфатазой, используя буфер, приложенный к фасовке фермента. Это же касается и тех случаев, когда требуется отдельная реакция дефосфорилирования концов ДНК.
Протокол постановки реакции с щелочной фосфатазой с предварительной обработкой ДНК эндонуклеазой рестрикции.
(1) Для щелочной фосфатазы из кишечника теленка (CIP).
На 50 мкл реакционной смеси:
- 5 мкл десятикратного SE буфера,
- 0.5-5 мкг ДНК,
- деионизованная вода – до 50 мкл.
Добавить 1-5 мкл эндонуклеазы рестрикции.
Инкубировать в течение 1 часа (либо 3-4 часов) при оптимальной температуре.
Добавить 1-2 мкл (5-10 ед.) щелочной фосфатазы (порядка 1-2 ед. на 1 мкг ДНК).
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 37°C.
Очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или путем экстракции фенолом-хлороформом с последующим высаживанием 96%-ным этанолом [1].
(2) Для термолабильной щелочной фосфатазы из A. undina P2.
На 50 мкл реакционной смеси:
- 5 мкл десятикратного SE буфера,
- 0.5-5 мкг ДНК,
- деионизованная вода – до 50 мкл.
Добавить 1-5 мкл эндонуклеазы рестрикции.
Инкубировать в течение 1 часа (либо 3-4 часов) при оптимальной температуре.
Добавить 1-2 мкл (5-10 ед.) щелочной фосфатазы (порядка 1-2 ед. на 1 мкг ДНК).
Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 25°C!!! (Инкубация при 37°C приводит к частичной инактивации фермента).
Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 10 мин.
Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.
1. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, P. 5.72. 2-nd Edition. 1989. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.