Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| (5mC)GNNNNNNN(5mC)G | (5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G |
| G(5mC)NNNNNNNG(5mC) | G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC) |
Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген PcsI I из Paracoccus carotinifaciens 3K.
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpySE49/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHpySE49/DriI и образование двух фрагментов ДНК.
| Определение активности PcsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpySE49/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 7 — 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2 — исходная ДНК pMHpySE49/DriI 3 — 0.25 мкл Pcs I 4 — 0.5 мкл Pcs I 5 — 1 мкл Pcs I 6 — 2 мкл Pcs IПродукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Плазмидная ДНК pMHpySE49, линеаризованная DriI (pMHpySE49/DriI). pMHpySE49 (3536 п.н.) получена путем лигирования вектора pMTL22/FauNDI/SmaI и
ПЦР-фрагмента, содержащего ген метилазы M.HpySE526I (образует 5′-A(5mC)GT-3′) и последовательность ДНК
5′-GACGTATAAAACGTT-3′
3′-CTGCATATTTTGCAA-5′
В результате, данный субстрат имеет оптимальный сайт PcsI:
5′-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3′
3′-TG(5mC)NNNNNNNG(5mC)A-5′
Оптимальный буфер: SE-буфер 3M
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 50-75 | 50-75 | 0 | 10-25 | 50-75 | 50 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 7 mM 2-меркаптоэтанол, 100 μg/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.Лигирование:
Неспецифический гидролиз: Неспецифического гидролиза не наблюдается при обработке 1 мкг ДНК фага лямбда 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.
После инкубации 5 ед фермента в течение 3 часов неспецифического гидролиза одно- и двуцепочечного олигонуклеотидов не наблюдается.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер 3M
