Двойной гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции (double digestion).
Для двойного гидролиза ДНК в соответствии с данным протоколом используются эндонуклеазы рестрикции для быстрого гидролиза (Turbo)
При необходимости осуществить гидролиз ДНК двумя рестриктазами одновременно мы рекомендуем использовать универсальный реакционный буфер “ROSE” (B021), либо один из буферов для эндонуклеаз рестрикции, в котором оба фермента проявляют не менее 50% активности. В противном случае лучше проводить последовательный гидролиз ДНК каждым ферментом отдельно с инактивацией рестриктазы после первого гидролиза.
Информацию об активности эндонуклеаз рестрикции в буфере “ROSE” и в других реакционных буферах можно найти в разделе Сервис/Активность рестриктаз).
Reaction Original SibEnzyme (ROSE) буфер – специально разработанный универсальный реакционный буфер для эндонуклеаз рестрикции. Подавляющее большинство эндонуклеаз рестрикции проявляют в нем 50-100% активности.
Стандартный протокол двойного гидролиза ДНК рестриктазами Turbo:
На 20 мкл реакционной смеси:
- Стерильная вода – до 20 мкл
- Оптимальный или универсальный реакционный буфер (x10) – 2 мкл;
- Препарат ДНК – от 0,2 до 1 мкг;
- BSA (10 мг/мл) (опционно)* – 0,2 мкл;
- + 1 мкл Рестриктазы №1 и 1 мкл Рестриктазы № 2
Инкубировать при оптимальной температуре в течение 0,5-1 часа.
*BSA следует добавлять в реакционную смесь, если хотя бы один из ферментов требует его добавления для достижения максимальной активности.
Примечание:
- Конечная концентрация глицерина в реакции гидролиза должна быть не более 5% во избежание проявления “звездчатой” активности рестриктаз, т.е. в стандартную реакционную смесь объемом 20 мкл не рекомендуется добавлять суммарно больше 2 мкл ферментов.
- Если у ферментов разные оптимальные температуры реакции, то рекомендуется проводить реакции гидролиза ферментами последовательно (начиная с более низкотемпературного фермента) с инактивацией рестриктазы после первого гидролиза.