Двойной гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции (double digestion).

При необходимости осуществить гидролиз ДНК двумя рестриктазами одновременно мы рекомендуем использовать универсальный реакционный буфер “ROSE” (B021), либо
один из буферов для эндонуклеаз рестрикции, в котором оба фермента проявляют не менее 50% активности. В противном случае лучше проводить последовательный гидролиз
ДНК ферментами, либо инкубировать реакционную смесь не менее 4 часов.
Информацию об активности эндонуклеаз рестрикции в буфере “ROSE” и в других реакционных буферах можно найти в разделе Сервис/Активность рестриктаз).
Reaction Original SibEnzyme (ROSE) буфер – специально разработанный универсальный реакционный буфер для эндонуклеаз рестрикции. Подавляющее большинство эндонуклеаз рестрикции проявляют в нем 50-100% активности. Может применяться для экспериментов, требующих проведения реакции с двумя ферментами одновременно и для Turbo эндонуклеаз рестрикции.

Стандартный протокол двойного гидролиза ДНК рестриктазами:

На 20 мкл реакционной смеси:
  • Оптимальный или универсальный реакционный буфер (x10) – 2 мкл;
  • Препарат ДНК – от 0,2 до 1 мкг;
  • BSA (10 мг/мл) (опционно)* – 0,2 мкл;
  • Стерильная вода – до 20 мкл
  • + 1 мкл Рестриктазы №1 и 1 мкл Рестриктазы № 2
Инкубировать при оптимальной температуре в течение 0,5-1 часа.
BSA следует добавлять в реакционную смесь, если хотя бы один из ферментов требует его добавления для достижения максимальной активности.

Примечание:

  • Конечная концентрация глицерина в реакции гидролиза должна быть не более 5% во избежание проявления “звездчатой” активности рестриктаз, т.е. в стандартную реакционную смесь объемом 20 мкл не рекомендуется добавлять суммарно больше 2 мкл ферментов.
  • Соотношение объема добавляемых в реакцию рестриктаз зависит от концентрации (в е.а./мкл) каждого из ферментов и от степени их активности при использовании неоптимального реакционного буфера. В этом случае менее активной рестриктазы нужно добавлять больше, а более активной – соответственно, меньше.
  • Если у ферментов разные оптимальные температуры реакции, то рекомендуется либо осуществлять гидролиз при 37oC (для ферментов, работающих в интервале температур 30-50oC), или 55 oC (для ферментов, работающих в интервале температур 55-65oC), увеличив, при необходимости, время инкубации до 4 часов, либо проводить реакции гидролиза ферментами последовательно.