Двойной гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции (double digestion).

Для двойного гидролиза ДНК в соответствии с данным протоколом используются эндонуклеазы рестрикции для быстрого гидролиза (Turbo)
При необходимости осуществить гидролиз ДНК двумя рестриктазами одновременно мы рекомендуем использовать универсальный реакционный буфер “ROSE” (B021), либо
один из буферов для эндонуклеаз рестрикции, в котором оба фермента проявляют не менее 50% активности. В противном случае лучше проводить последовательный гидролиз ДНК ферментами, либо инкубировать реакционную смесь не менее 4 часов.
Информацию об активности эндонуклеаз рестрикции в буфере “ROSE” и в других реакционных буферах можно найти в разделе Сервис/Активность рестриктаз).
Reaction Original SibEnzyme (ROSE) буфер – специально разработанный универсальный реакционный буфер для эндонуклеаз рестрикции. Подавляющее большинство эндонуклеаз рестрикции проявляют в нем 50-100% активности. Может применяться для экспериментов, требующих проведения реакции с двумя ферментами одновременно и для Turbo эндонуклеаз рестрикции.

Стандартный протокол двойного гидролиза ДНК рестриктазами Turbo:

На 20 мкл реакционной смеси:
  • Оптимальный или универсальный реакционный буфер (x10) – 2 мкл;
  • Препарат ДНК – от 0,2 до 1 мкг;
  • BSA (10 мг/мл) (опционно)* – 0,2 мкл;
  • Стерильная вода – до 20 мкл
  • + 1 мкл Рестриктазы №1 и 1 мкл Рестриктазы № 2
Инкубировать при оптимальной температуре в течение 0,5-1 часа.
BSA следует добавлять в реакционную смесь, если хотя бы один из ферментов требует его добавления для достижения максимальной активности.

Примечание:

  • Конечная концентрация глицерина в реакции гидролиза должна быть не более 5% во избежание проявления “звездчатой” активности рестриктаз, т.е. в стандартную реакционную смесь объемом 20 мкл не рекомендуется добавлять суммарно больше 2 мкл ферментов.
  • Соотношение объема добавляемых в реакцию рестриктаз зависит от концентрации (в е.а./мкл) каждого из ферментов и от степени их активности при использовании неоптимального реакционного буфера. В этом случае менее активной рестриктазы нужно добавлять больше, а более активной – соответственно, меньше.
  • Если у ферментов разные оптимальные температуры реакции, то рекомендуется либо осуществлять гидролиз при 37oC (для ферментов, работающих в интервале температур 30-50oC), или 55 oC (для ферментов, работающих в интервале температур 55-65oC), увеличив, при необходимости, время инкубации до 4 часов, либо проводить реакции гидролиза ферментами последовательно.