Описание
Сайт узнавания:
| G(5mC)N↑GC |
| (5mC)G↓N(5mC)G |
Источник: Bacillus simplex 23
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза, как минимум, одного сайта
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`
в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4).
| Определение активности BlsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 7 — 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Bls I 3: 0.5 мкл Bls I (1/5) 4: 1 мкл Bls I (1/5) 5: 2 мкл Bls I (1/5) 6: 1 мкл неразбавленного фермента Bls I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три канонических сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2, 3].
Оптимальный буфер: SE-буфер W
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 10 | 10 | 50 | 100 | 75 | 50 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 5 ед фермента Bls I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W.
Примечание:
Литература:
1. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Bacillus simplex — продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bls I.// Патент на изобретение RU 2322494 С1 (2006)
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)
3. Дегтярев С.Х., Приходько Г.Г., Речкунова Н.И. Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции SfeI. // Биоорганическая химия, Т.14, № 6, 848-849 (1988).
4. 
Чернухин В.А., Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Болтенгаген А.А., Голикова Л.Н., Дегтрев С. Х. Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5` -RYNRY- 3` при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов.// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38 (2013).
Применение:
Дегтярев С.Х., Репин В.Е., Речкунова Н.И. Штамм бактерий Proteus vulgaris — продуцент рестриктазы PvuII. // Авторское свидетельство SU 1632974 (1991).
Колыхалов А.А., Репин В.Е., Фиш А.М., Речкунова Н.И., Дегтярев С.Х. Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Vha464I. // Сибирский биологический журнал, Вып.1, 60-61 (1991).
Degtyarev S. Kh., Kolyhalov A.A., Rechkunova N.I., Abdurashitov M.A. Acs I, a new restriction endonuclease from Arthrobacter citreus 310 recognizing 5′-Pu^AATTPy-3′. // Nucleic Acids Research, Vol. 20, No.14 (1992)
