Описание
Сайт узнавания:
| (5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G |
| G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC) |
Источник: Paracoccus carotinifaciens 3K
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3`
в 1 мкг ДНК плазмиды pMHgaI/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHgaI/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4) и образование двух фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5).
| Определение активности PcsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHgaI/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 6 — 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: исходная ДНК , pMHgaI/DriI 3: 0.5 мкл Pcs I 4: 1 мкл Pcs I 5: 2 мкл Pcs IПродукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Плазмида pMHgaI содержит гены ДНК-метилтрансфераз
M1.HgaI (сайт узнавания 5`-CGCTC-3`)
и M2.HgaI (сайт узнавания 5`-GACGC-3`)
и содержит единственный сайт узнавания PcsI :
5`-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3`
3`-WG(5 m C)NNNNNNNG(5mC)W-5` [1].
Оптимальный буфер: SE-буфер PcsI
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 50 | 25 | 10 | 50 | 20 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 100 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Pcs I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер PcsI
Примечание:
Литература:
1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K — продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2009).
