Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| G(5mC)NGC | G(5mC)N↑GC |
| (5mC)GN(5mC)G | (5mC)G↓N(5mC)G |
Источник: Bacillus simplex 23
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза, как минимум, одного сайта
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`
в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4).
| Определение активности BlsI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 7 – 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Bls I 3: 0.5 мкл Bls I (1/5) 4: 1 мкл Bls I (1/5) 5: 2 мкл Bls I (1/5) 6: 1 мкл неразбавленного фермента Bls I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три канонических сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2, 3].
Оптимальный буфер: SE-буфер W
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 10 | 10 | 50 | 100 | 75 | 50 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 5 ед фермента Bls I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W.
Примечание:
Литература:
- Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Bacillus simplex – продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bls I.// Патент на изобретение RU 2322494 С1 (2006)
- Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)
- В.А. Чернухин, Ю.Э. Томилова, Е.В. Чмуж, О.О. Соколова, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, т. 3, №1, с. 28-33
- Чернухин В.А., Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Болтенгаген А.А., Голикова Л.Н., Дегтрев С. Х. Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5` -RYNRY- 3` при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов.// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38 (2013).
Применение:
- В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
- Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2010. – Т. 6 – № 1 – С. 5-12
- А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 – 16
