Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| G(5mC)G(5mC)NG(5mC)G(5mC) | G(5mC)G(5mC)↑NG(5mC)G(5mC) |
| (5mC)G(5mC)GN(5mC)G(5mC)G | (5mC)G(5mC)GN↓(5mC)G(5mC)G |
Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Mte I из Microbacterium testaceum 17B
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10/DriI дополнительно метилированной M.Fsp4HI за 1 час при 55°С в 50 мкл реакционной смеси
Определение активности MteI
В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.
| Дорожки: 2 – Контрольная ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI, 3 – 0.5 мкл MteI (разб. 1/40), 4 – 1 мкл MteI (разб. 1/40), 5 – 2 мкл MteI (разб. 1/40), 6 – 1 мкл неразбавленного фермента MteI, 1 и 7- 1 Kb SE ДНК-маркеры.Продукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE |
 |
Субстрат для определения активности:
Субстрат pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI10, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI и метилированной ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI. Плазмида pHspAI10 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HspAI, которая модифицирует сайт узнавания
5`-GCGC-3` с образованием
5`-G(5mC)GC-3`/3`-CG(5mC)G-5`.
Кроме того, данная плазмида дополнительно метилирована ДНК-метилтрасферазой М.Fsp4HI, которая модифицирует сайт
5`-GCNGC-3` с образованием
5`-G(5mC)NGC-3`/3`-CGN(5mC)G-5`.
В результате в используемом субстрате имеется один канонический сайт узнавания МteI:
5`-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5`.
МteI может также расщеплять сайт узнавания, включающий шесть 5-метилцитозинов [1], однако активность фермента в этом случае меньше более чем на порядок.
Оптимальный буфер: SE-буфер W
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 25 | 75 | 75 | 100 | 50 | 100 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 40 ед фермента Mte I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 55°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W, pHspAI10/DriI дополнительно метилированная M.Fsp4HI .
Примечание:
Литература:
1. В.А. Чернухин, Д.А. Гончар, Е.В. Килёва, В.А. Соколова, Л.Н. Голикова, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярёв Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК- эндонуклеаза MteI расщепляет последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2012. – Т. 8 – № 1 – С. 16 – 26
2. Абдурашитов М.А., Куксова А.Н., Акишев А.Г., Землянская Е.В., Дегтярев С.Х.MteI-ПЦР анализ – новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 3 ,с. 15-23 (2013)
