Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| G(5mC)NG(5mC) | G(5mC)N↑G(5mC) |
| (5mC)GN(5mC)G | (5mC)G↓N(5mC)G |
Источник: Planomicrobium koreense 78k
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси (см. рисунок ниже, дор. 4).
| Определение активности PkrI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель.Дорожки: 1 и 6 – 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Pkr I 3: 0.5 мкл Pkr I 4: 1 мкл Pkr I 5: 2 мкл Pkr I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
.
Субстрат для определения активности:
Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три сайта:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2].
Оптимальный буфер: SE-буфер Y
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 50 | 75 | 10 | 25 | 100 | 100 |
Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 2 ед фермента Pkr I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y.
Примечание:
Литература:
1.В.А. Чернухин, Наякшина Т.Н, Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярёв С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5′-GCN^GC-3’/3′-CG^NCG-5′, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 35 – 42
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология, т.41, №1, с. 43-50 (2007)
