Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| GC(5mC)GGC | G↑C(5mC)GGC |
| CGG(5mC)CG | CGG(5mC)C↓G |
Источник: Kocurea rosea 307
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое дляполного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pMHpaII1/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
| Определение активности KroI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pMHpaII1/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 – 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2 – исходная ДНК , pMHpaII1/DriI 3 – 0.5 мкл Kro I 4 – 1 мкл Kro I 5 – 2 мкл Kro IПродукты разделены в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Субстрат pMHpaII1/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHpaII1, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHpaII1 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HpaII, которая модифицирует сайт узнавания 5`-CCGG-3` с образованием
5`-C(5mC)GG-3`/3`-GG(5mC)C-5`,
и три сайта узнавания KroI
5`-GC(5mC)GGC-3`/3`-CGG(5mC)CG-5`.
Оптимальный буфер: SE-буфер G
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 50 | 100 | 25 | 50 | 75 | 100 |
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 200 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Kro I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1] и ДНК, метилированную MspI ДНК-метилтрансферазой.
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер G.
Примечание:
Литература:
1. Чернухин В.А., Журавлева Р.О., Тарасова Г.В., Болтенгаген А.А., Акишев А.Г., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Kocuria rosea – продуцент сайт-специфической эндонуклеазы KroI. // Патент на изобретение RU 2394099 С1 (2010)
2.В.А. Чернухин, Е.В. Килёва, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, Д.А. Гончар, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярёв Новая метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнаёт и расщепляет последовательность ДНК 5′-G^C(5mC)GGC-3′ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 1 – С. 14 – 20
