Описание
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
| G(5mC)NG(5mC) | G(5mC)↑NG(5mC) |
| (5mC)GN(5mC)G | (5mC)GN↓(5mC)G |
Источник: Glacial ice bacterium GL24
Определение единицы активности:
За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5`
в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 4-6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCNGC-3`/3`-CGNCG-5`, имеющим три 5-метилцитозина.
| Определение активности GluI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pFsp4HI3/DriI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Дорожки: 1 и 6 – 1 Kb SE ДНК-маркеры. 2: 0 мкл Glu I 3: 0.5 мкл Glu I 4: 1 мкл Glu I 5: 2 мкл Glu I Продукты разделены в 1,4%-ном агарозном геле в буфере TAE. |
 |
Субстрат для определения активности:
Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и один канонический сайт:
5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` [2].
Оптимальный буфер: SE-буфер Y
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
| B | G | O | W | Y | ROSE |
| 75 | 75 | 25 | 50 | 100 | 100 |
Условия хранения: 10 mM KH2PO4 (pH 7.45); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Лигирование:
Неспецифический гидролиз:
Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Glu I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только C5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y.
Примечание:
Литература:
1. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Glacial ice bacterium – продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Glu I.// Патент на изобретение RU 2322492 С1 (2006)
2. В.А. Чернухин, Е.В. Чмуж, Ю.Э. Томилова, Т.Н. Наякшина, Д.А. Гончар, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярев Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, Т. 3, №2, с. 13-17
Применение:
В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.
Kravets AP, Mousseau TA, Litvinchuk AV, Ostermiller Sh, Vengen GS, Grodzinski DM. Changes in wheat DNA methylation pattern after chronic seed gamma-irradiation.// Tsitol Genet. 2010 Sep-Oct;44(5):18-22. Russian.
